离子液体制剂和组织处理方法及其应用

本发明涉及离子液体及其应用，具体而言，本发明涉及一种亲水的、高折射率的无定形离子液体制剂，及使用该离子液体制剂的生物组织处理方法和该离子液体在这些生物组织处理方法中的应用。

背景技术：

1、离子液体是一种由有机阳离子和无机(或有机)阴离子构成的在室温下呈液态的熔融盐体系。离子液体无味、不燃、蒸气压极低，几乎不会挥发，具有高度的热稳定性与化学稳定性。通过功能化基团的修饰，可以创造出符合各种要求的功能化离子液体。基于离子液体的这些特性，能够寻找适合于生物组织处理的离子液体制剂。

2、生物组织处理方法包括但不限于无形变组织透明化方法、超低温玻璃化组织无损保存方法、低温荧光增强方法、无冰晶冷冻切片方法、膨胀后组织冷冻切片方法和超分辨成像方法等。

3、1.组织透明化

4、组织透明化利用脱脂与脱色过程去除折射率不均一的物质与色素，并使用折射率匹配液将组织折射率匹配到较高的统一水平，从而减少光的散射、折射与反射，使处理后的组织呈现出透明效果。目前传统的折射率匹配试剂分为有机溶剂和亲水性试剂。

5、有机溶剂透明化方法包含babb、disco系列，使用醇类或醚类(例如四氢呋喃)等物质进行脱水与脱脂，从而去除折射率较低的水组分，并使用有机溶剂进行透明化。虽然有机溶剂折射率较高、透明化效果好，但其对荧光的保存效果较差，还可能产生大量自发荧光，且高浓度有机溶剂会对组织产生极大破坏。此外，有机溶剂配方中含有四氢呋喃等毒性较强试剂，对人体健康可能有损伤。而且脱水过程会使组织收缩。

6、水性透明化方法会使组织出现膨胀现象。亲水性试剂大多基于尿素的超水化性质，会导致蛋白质的变性，引起组织膨胀，且许多方法透明化速度慢，安替比林等折射率匹配物质达到饱和容易结晶破坏组织。此外，亲水性试剂水含量高，其折射率难以达到较高水平。由于水含量高的缘故，其透明度会较低，且为了防止高浓度折射率匹配剂结晶，只能进行常温保存，对荧光不友好。与此同时，水性透明化处理的组织刚性下降，容易变形破碎，因此对于样品保存也是不友好的。

7、2.超低温玻璃化保存

8、超低温玻璃化保存利用高浓度冰冻保护剂和液氮降温，使脱水样品玻璃化而没有冰晶的产生，从而实现细胞、组织或器官的长期冷冻保存，维持其基本结构或生存能力。

9、在玻璃态时，水分子不发生重排，不产生结构和体积的变化，因而不会由于机械损伤或溶液效应造成组织伤害。但现有超低温玻璃化保存技术使用的冰冻保护剂浓度很高，且部分组分例如二甲基亚砜(dmso)对材料毒害性极大，需要严格控制脱水过程与冰冻保护剂的渗透性。此外，在实际操作中，冰冻保护剂只能减少冰晶的形成，而不能完全抑制，因此仍然在一定程度上造成组织损伤。另外，现有超低温玻璃化方法主要利用液氮速冻来防止冰晶形成，但超低温玻璃化保存的样本在复温过程中容易形成重结晶的冰晶损害样本，使得该方法操作难度大，且风险很高。

10、3.低温荧光增强

11、荧光强度对温度有敏感响应。温度上升时激发分子接受额外热能，可能将激发能转化为基态振动能，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。此外，溶液体系中，温度下降使介质粘度增大，荧光物质与溶剂分子的碰撞减少，去活化几率减少。因此，荧光物质在低温下荧光强度相较室温显著增强。

12、近年来荧光的低温性质越来越得到关注，在荧光成像当中，较低温度下荧光蛋白的光漂白会减少。然而水性体系在低温下易形成冰晶，对组织造成损伤，因此样品制备成为低温荧光成像面临的一大挑战。此外，目前领域内没有通过低温进行专门荧光增强的成像体系，冷冻成像的样品大多为冷冻电镜的光电联合成像时使用。对于冷冻电镜样本来说，同样面对着重结晶的问题，且激发荧光的激光也有可能导致样品的冻融，使得这一方法没有太多的推广。

13、4.冷冻切片

14、冷冻切片方法是一种在低温环境下使组织在较短时间内达到合适硬度，随后进行切片的方法。切片制作的关键之一在于冷冻速度。冷冻速度过慢易产生较大的冰晶颗粒，从而挤压细胞或使细胞间隙增大，或通过冰晶边缘切断微观组织，待冰晶融化时留下大量空泡、空核，组织形态也会出现间隙增大，结构改变等现象。

15、现有方法主要通过冷冻保护剂的使用和切片技术的改良(例如液氮骤冷)来减少冷冻切片中冰晶对细胞组织的损伤，但只能在一定程度上减少冰晶形成，而无法彻底抑制冰晶形成。此外，现有的冷冻切片方法通过蔗糖等物质进行脱水，或使用可穿透细胞膜的冷冻保护剂进行冷冻保护。这些方法在低温当中只能做到抑制冰晶的形成，且对温度控制有着极高要求，否则将会面临结晶或者重结晶对样本的损毁。且冷冻时形成的冰晶会导致切片过程对样品有损伤，导致微观结构的改变。

16、5.膨胀显微成像

17、膨胀显微成像是一种新型超分辨成像技术，借助水凝胶膨胀均匀放大生物样本，在常规光学成像条件下实现超分辨成像。膨胀成像适用于细胞、组织切片等多种类型的样本，蛋白质、核酸、脂质等生物大分子均可借助膨胀成像进行超分辨成像。此外，膨胀成像与共聚焦显微镜、光片显微镜、超高分辨显微镜多尺度联合使用。在超分辨显微镜下，膨胀结合切片可进一步将分辨率提高至纳米级别。

18、然而，膨胀后样本含水量极高，脆弱易碎，难以进行下一步组织处理(例如转移、冷冻切片等)，且膨胀带来的荧光强度稀释与酶消化过程对荧光蛋白的破坏都会导致荧光强度的减弱，从而影响成像质量。而且，现有的组织膨胀方法面临着难以保存组织、无法进行冷冻切片、只能通过长工作距离的低倍物镜进行成像的问题。

19、因此，亟需提供一种能够解决上述问题的生物组织处理方法。

技术实现思路

1、为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种亲水离子液体制剂，其可以用于组织学中的各种组织处理技术当中，包括但不限于组织透明化方法、超低温玻璃化组织保存方法、低温荧光增强方法、无冰晶冷冻切片方法、膨胀后组织冷冻切片方法和超分辨成像方法等。

2、本发明的第一方面提供一种亲水的无定形离子液体制剂，其包含以下组分：

3、a)含有阳离子和阴离子的离子液体，所述阳离子包含氨基取代的含氮杂环化合物或亚胺类化合物，所述阴离子包含含羧基或磺基的化合物；

4、b)调节组分a)的性质的助剂，其包括安替比林、烟酰胺、烟酸和1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷中的一种或多种；

5、c)水；和

6、d)能稳定存在于所述离子液体制剂中的还原剂。

7、优选地，组分a)中的所述阳离子与所述阴离子的摩尔比接近或等于其电荷比的倒数，使得所述阳离子和所述阴离子充分电离并且电荷基本相同。所述阳离子优选包含1-(3-氨基丙基)-咪唑。所述阴离子优选包含邻苯二甲酸。

8、在一个实施方式中，所述氨基取代的含氮杂环化合物可以是取代有一个或多个氨基烷基的含氮杂环。在一个实施方式中，所述一个或多个氨基烷基可以各自独立地为氨基c1-8烷基、氨基c1-6烷基、氨基c1-3烷基、氨基c3-6环烷基等。在一个实施方式中，所述含氮杂环可以是单环或稠环，例如可以是五元或六元含氮杂环，例如咪唑、咪唑啉、咪唑烷、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、三唑、四唑、吡啶、哌啶、哌嗪、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪等；也可以是八至十四元含氮杂环稠环，例如二氢吡咯并吡咯、四氢环戊二烯并吡咯、吲哚、异吲哚、吲哚啉、吲唑、苯并咪唑、氮杂吲哚、喹啉、异喹啉及其加氢产物等。在一个实施方式中，含氮杂环还可以可选地包含例如o和s等其他杂原子。在一个实施方式中，所述氨基烷基在含氮杂环上的取代位置没有限制，但优选为氮原子。在一个优选实施方式中，所述氨基取代的含氮杂环化合物是n-(氨基c1-6烷基)-五元或六元含氮杂环单环，优选n-(氨基c1-6烷基)-咪唑，例如1-(3-氨基丙基)-咪唑。

9、在一个实施方式中，所述含羧基或磺基的化合物可以是脂肪族或芳香族的一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸、一元磺酸、二元磺酸等。在一个实施方式中，所述含羧基或磺基的化合物可以是碳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、磺酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、苯二磺酸等。在一个优选实施方式中，所述含羧基或磺基的化合物是苯甲酸或苯二甲酸，例如邻苯二甲酸。

10、优选地，组分b)的助剂能够稳定存在于离子液体体系中，并对荧光和组织结构有保护作用，和/或能够提高折射率，和/或能够降低粘度。

11、优选地，组分c)的水为超纯水，优选去氧超纯水，例如经过煮沸去氧处理的超纯水。

12、优选地，组分d)的还原剂用于保护其他组分不受空气中氧气影响。组分d)的还原剂优选包含焦亚硫酸钾。

13、优选地，基于所述离子液体制剂的总体积，组分a)的质量体积比浓度(w/v％)为35％至95％，组分b)的质量体积比浓度为4％至50％，组分c)的质量体积比浓度为5％至45％，组分d)的质量体积比浓度为0.1％至2.0％；更优选地，基于所述离子液体制剂的总体积，组分a)的质量体积比浓度为75％至90％，组分b)的质量体积比浓度为6％至23％，组分c)的质量体积比浓度为10％至40％，组分d)的质量体积比浓度为0.1％至1.0％。

14、在本发明的一个更优选的具体实施方式中，离子液体制剂包括：质量体积比浓度(w/v％)为10％至40％的水，质量体积比浓度为40％至60％的1-(3-氨基丙基)-咪唑，质量体积比浓度为0.2％至0.8％的焦亚硫酸钾，质量体积比浓度为35％至65％的邻苯二甲酸，质量体积比浓度为8％以下(例如1％至8％、2％至6％)的安替比林，和质量体积比浓度为5％至15％的烟酰胺，其中，作为阳离子的1-(3-氨基丙基)-咪唑与作为阴离子的邻苯二甲酸的浓度满足上述组分a)中限定的阳离子与阴离子的摩尔比。

15、最优选地，在本发明的示例性实施方式中，离子液体制剂包括：质量体积比浓度(w/v％)为26％的水，质量体积比浓度为56％的1-(3-氨基丙基)-咪唑，质量体积比浓度为0.5％的焦亚硫酸钾，质量体积比浓度为40％的邻苯二甲酸，质量体积比浓度为5％的安替比林，和质量体积比浓度为10％的烟酰胺。

16、所述离子液体制剂为无定形态，并且优选地在室温下保持液态。

17、优选地，所述离子液体制剂的折射率为1.50以上，优选为1.50至1.55，更优选为1.51至1.54。所述离子液体制剂的折射率可以通过调整组分a)、b)、c)的配比来实现。

18、本发明的第二方面提供一种制备上述离子液体制剂的方法，所述方法包括：在容器中将所述组分a)-d)配制成制剂，和向所述容器中充入例如氮气、氩气、氦气等惰性气体进行惰性保护，并将容器密封。

19、在上述制剂和方法中，所用的药品和试剂的来源为直接购买或制备的分析纯以上的试剂或药品。离子液体的制备方法使用本领域中技术人员公知的方法，例如但不仅限于使用超声与微波等物理手段进行加速的方法。

20、可选地，除配制时提前确定配比外，所述制剂也可以通过冷冻干燥、真空干燥以及加入干燥剂的方法降低水成分的含量并提高折射率或满足其他需要。

21、本发明的第三方面提供一种生物组织处理方法，具体地，提供了一种生物组织透明化方法，包括：使用上述离子液体制剂处理脱脂的生物组织或生物组织切片，以进行折射率匹配，所述处理优选包括灌流、浸泡或浸润；一种低温玻璃化组织保存方法，包括：使用上述离子液体制剂浸润生物组织，并在室温以下的温度下保存经浸润的生物组织，例如在0℃以下、-20℃、-40℃以下或-80℃以下的温度下保存；一种低温荧光光学增强成像方法，包括：使用上述离子液体制剂处理带荧光的生物组织，并在室温以下对经处理的生物组织进行成像，例如在0℃以下、-20℃、-40℃以下或-80℃以下的的温度下成像；一种无冰晶冷冻切片方法，包括：使用上述离子液体制剂处理生物组织，将经处理的生物组织冷冻，并进行切片；一种膨胀后组织的保存与冷冻切片方法，包括：将经多聚甲醛固定后的生物组织进行膨胀并二次固定，将固定后的膨胀生物组织样品浸泡于上述离子液体制剂中，待其形状稳定后冷冻，并进行保存或冷冻切片。

22、本发明的第四方面提供了上述离子液体制剂在生物组织处理中的应用，所述生物组织处理包括组织透明化、低温玻璃化组织保存、低温荧光增强、无冰晶冷冻切片、膨胀后组织冷冻切片和超分辨成像中的一种或多种。