单囊泡储存神经递质的电化学定量分析方法

本发明涉及囊泡内储存的神经递质的检测方法，特别涉及一种单囊泡内储存神经递质(如乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、谷氨酸等)的定量分析方法，属于脑化学和电分析化学领域

背景技术：

1、乙酰胆碱(acetylcholine，ach)是胆碱能神经元分泌的主要神经递质，广泛存在于外周和中枢神经系统中，其主要功能是完成神经信号的传递。乙酰胆碱在神经囊泡中的储存与释放与多种神经系统疾病发生发展密切相关，如阿尔茨海默症、帕金森综合症、重症肌无力等。因此，定量监测囊泡内乙酰胆碱的储存，追踪乙酰胆碱在神经元内的代谢过程，对这些疾病的诊断和治疗具有重要意义。

2、目前对于乙酰胆碱的检测，主要有质谱法、荧光分析法、核磁共振法以及酶电极电分析法等，然而这些方法受限于其方法的灵敏度和时间与空间分辨率，不能直接实现对单个神经囊泡内储存乙酰胆碱的定量分析。同时对于单个神经囊泡内储存的其他非电活性神经递质，如γ-氨基丁酸等，目前也没有有效的分析方法。

3、液/液界面是基于两种不混溶电解质溶液之间所形成的界面(interface betweentwo immiscible electrolyte solutions，ities)，在给定的电压下，带电待测物在有机相与水相之间发生离子转移，产生电信号，通过对电信号的分析可实现对单囊泡内储存神经递质的定量分析。在此过程中，电位-电流关系图可用于神经递质的定性分析，电流-时间曲线可实现定量分析。

技术实现思路

1、目前在单个神经囊泡层次还不能实现乙酰胆碱等神经递质囊泡储存的定量、高通量分析。液/液界面电极可实现非电活性神经递质的检测，且灵敏度较高、操作简单。本发明的目的是针对现有方法的缺失，通过发展新的单囊泡化学分析原理，合理构建液/液界面体系，建立一种单囊泡储存神经递质的定量分析方法，实现对人工囊泡以及生物神经囊泡储存神经递质的定量、高通量分析。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种单囊泡储存神经递质的电化学定量分析方法，包括以下步骤：

4、1)构筑电分析定量平台：以液/液界面电极(ities电极)为工作电极，与对电极(同时为参比电极)组成两电极系统，通过微电流放大器实时监测电流信号；其中，所述液/液界面电极为内设导丝的空心管电极。

5、在本发明的一些具体实施方式中，所述液/液界面电极通过下述方法制备得到：将玻璃毛细管拉制成具有尖端的空心管电极，将电极尖端的内径控制在5-10μm；将拉制好的空心管电极硅烷化(置于含有三甲基氯硅烷的真空干燥器中一段时间，然后烘干得到硅烷化空心管电极)。使用时，空心管电极内部注入有机相，外部为水相，或者，空心管电极内部注入水相，外部为有机相，将导丝插入空心管电极内并浸没在电极内部溶液里，从而构成所述液/液界面电极。所述有机相不能与水互溶，对支持电解质溶解性较强，且加入支持电解质导电性较好。例如含有支持电解质的1,2-二氯乙烷(1,2-dce)，所述支持电解质可以是2-10mm四苯基硼酸四丁基铵(thatpb)或四(五氟苯基)硼酸双(三苯基膦)铵(btppatpbf)。

6、所述对电极可以选择ag/agcl电极。ities电极内可以选择长度合适的铂丝或银丝作为导丝浸没在电极内部溶液里，确保整个电路导通。

7、通过正置显微镜及相关拍摄软件实现对电极位置的精确定位，借助电动显微操作仪操控电极，使用微电流放大器和数据采集软件实现对液/液界面处离子转移产生的即时电流信号的实时监测，精确记录液/液界面处离子的转移事件，从而实现对单神经囊泡储存神经递质的高灵敏度定量分析。

8、进一步的，电化学定量分析平台还包括噪音屏蔽系统，由法拉第屏蔽笼、防震台和气体发生器组成，其中法拉第屏蔽笼可屏蔽环境中的电磁噪音，防震台为工作平台，用以减少任何可能的震动干扰，气体发生器可为防震台提供相应的气体支撑。通过这样的配置，实验环境得以维持在一个稳定可控的状态，从而保障了实验数据的可靠性和准确性。

9、2)单个神经囊泡储存神经递质的电分析检测：在液/液界面电极内注入有机相，然后插入囊泡溶液中，或者，在液/液界面电极内注入囊泡溶液，然后插入有机相中；对电极插入液/液界面电极外部的囊泡溶液或有机相中；在两个电极间施加恒定电压，囊泡随机扩散至液/液界面并破膜释放神经递质，带电神经递质在液/液界面的转移引起电流瞬变，使用微电流放大器实时采集电流。

10、在本发明的一些具体实施方式中，基于上述电分析定量平台，将注入有机相的液/液界面电极固定于电极夹持器上，并通过电动显微操作仪插入到囊泡溶液中，施加某一恒定电压，囊泡随机扩散至液/液界面并破膜释放神经递质如乙酰胆碱，引起电流瞬变，使用微电流放大器实时采集电流，记录的电流-时间图，电流峰反映了囊泡在液/液界面释放神经递质的过程。

11、在本发明的一些实施例中，依据循环伏安法(cv)的结果，选择了内径为5-10μm的玻璃空心电极，并确定了检测乙酰胆碱时的转移电位在-0.6v至-0.1v范围内，设置采样频率为10khz，滤波频率为2.9khz。实验中首先使液/液界面电极在囊泡溶液中稳定一段时间以达到稳定状态，基线平稳后开始记录数据。

12、对于不同的神经递质，需要选择适配的有机相及缓冲溶液，并通过循环伏安法等电化学方法确定其转移电位等，然后进行囊泡的电化学检测。例如，检测囊泡内γ-氨基丁酸时，有机相中需加入有机酸使γ-氨基丁酸带正电。

13、3)计算单个神经囊泡储存的神经递质的分子数：基于法拉第定律，通过计算步骤2)记录的电流峰对时间的积分面积，得到每个囊泡所储存的神经递质的分子数。

14、在本发明的一些实施例中，每个电流峰对时间的积分面积为转移神经递质的电荷数，通过法拉第定律，计算可得到每个囊泡所储存的乙酰胆碱分子数。通过对人工囊泡的检测，使用计算得到的囊泡电分析半径与动态光散射(dls)测量结果进行比较，可验证本方法的可行性和可靠性。

15、囊泡储存的乙酰胆碱分子数计算原理：

16、通过电分析检测后，能够得到一系列的电流信号峰，每个瞬时电流变化被记录为一个尖峰，代表单个囊泡与液/液界面发生碰撞并融合后释放出的乙酰胆碱离子穿过界面所产生的电流，通过对电流峰面积的计算可得出乙酰胆碱转移产生的总电荷量q。这一电荷量与囊泡储存的乙酰胆碱分子数量之间存在直接的量化关系。依据法拉第定律，可以将电荷量q转换为特定神经递质分子的数量n，n＝q/nf，其中f为法拉第常数，96485c/mol，n代表神经递质分子的数目，n表示单个递质分子在界面上转移的电荷数(对于乙酰胆碱而言，n＝1)。因此，本发明对人工囊泡中乙酰胆碱浓度的检测中，通过公式n＝n×na以及n＝c×v，能够从电分析实验得到的乙酰胆碱分子数n，以及已知的装载乙酰胆碱的浓度c，计算出单个囊泡的直径，再将计算所得到的囊泡直径与dls所测得的结果进行比较，可验证本发明方法的可行性和可靠性。其中，na是阿伏伽德罗常数，一般计算时取6.02×1023或6.022×1023；c为人工囊泡中乙酰胆碱的浓度；v为人工囊泡的体积，v＝(4/3)πr3。

17、本发明通过合理构筑电分析定量平台，创新性地提出了用液/液界面电极在单个囊泡层面检测非电活性神经递质储存的新思路，实现了单个囊泡储存非电活性神经递质的原位定量分析。实验表明，该方法不局限于人工囊泡，还可以适用于不同脑区各类神经元囊泡储存神经递质的定量分析研究。本发明方法将单囊泡非电活性神经递质储存电分析定量方法应用到不同脑区(海马区、纹状体、腹侧被盖区、蓝斑核与中缝核等)中各类神经递质(乙酰胆碱、γ-氨基丁酸与谷氨酸等)的检测，从神经化学信号转导的角度揭示引起各类神经疾病认知功能障碍的分子机制，有望为神经生理学研究提供全新的视角与研究方法。