高度仿生型多功能组织工程化骨膜及其制备方法和应用

本发明涉及生物医学工程，特别是一种高度仿生型多功能组织工程化骨膜及其制备方法和应用。

背景技术：

1、修复由创伤、肿瘤切除或先天性畸形引起的大骨缺损一直是骨科的重大临床挑战。自体移植物和同种异体移植物被认为是骨缺损修复的金标准疗法，但受到多种因素的限制，包括供体有限、疾病传播和免疫应答等多种因素的限制。组织工程技术通过结合细胞和生物材料来修复组织缺陷，为解决这些问题提供了新的选择。然而，由于成骨效率低和血管形成能力不足，组织工程化骨修复支架在临床应用方面仍然面临挑战。

2、天然骨膜作为一种高度复杂且多功能的结缔组织，广泛覆盖于各种骨骼外表面，内部密布微血管系统与骨细胞网络。从结构角度，骨膜可精细划分为三层：最内层为紧贴骨面的生发层（inner cambium layer），由疏松排列的纤维基质构成，富含具有成骨潜能的细胞群，是骨组织再生与修复的关键区域；中间层为基质层（matrix layer），其内部富含密集且层状排列的微血管网络，可有效为生发层运输营养物质和排泄代谢产物，并在骨损伤修复中发挥输送骨祖细胞的作用；最外层为浅表纤维层（outer fibrous layer），主要由粗大的胶原纤维束、弹性蛋白和成纤维细胞组成的纤维化区，不仅作为骨表面的主要防御屏障，还参与维持骨组织的稳定性和形态。天然骨膜具有复杂的三维结构和多功能性，使其在骨修复与再生过程中起着关键作用。在骨愈合阶段，骨膜依靠其丰富的血液供给系统和细胞储备，显著促进骨祖细胞的激活，从而加速骨组织的再生与重建。因此，仿生构建出具备类似天然骨膜三层结构及多功能性的组织工程化骨膜具有重要意义。

3、当前，国内外学者在应用组织工程技术构建仿生骨膜方面已经取得了一定进展。其中，静电纺丝技术通过高压电场作用，可产生直径从纳米级至微米级的纤维，与天然细胞外基质构成的三维网状结构极为相似。此外，电纺纤维支架的高比表面积有助于细胞粘附、药物装载和物质交换。因此，静电纺丝技术在构建仿生骨膜基底支架方面具有显著优势，能够高效、便捷、大规模地制备出与天然基质在组成、结构和力学特性等方面相似的柔性膜状支架，适用于包裹各种大小和形状的骨缺损。

4、近年来，部分国内外学者开始运用静电纺丝技术构建组织工程化骨膜。然而，目前构建的组织工程骨膜主要集中于模拟天然骨膜生发层的成骨特性，而忽略了基质层中微血管化网络对骨形成的重要作用。此外，静电纺丝技术制备的微纳米纤维支架孔径较小，限制了细胞的迁移和浸润生长，无法充分模拟天然骨膜内多细胞的空间分布，难以形成功能仿生型骨膜样组织。因此，开发一种能够模拟并再现天然骨膜复杂三维结构与功能的组织工程化仿生支架，已成为当前科研领域亟待攻克的关键技术挑战，对于推动骨组织修复与再生技术的进步具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明涉及组织工程领域，特别是关于一种高度仿生型、多功能的组织工程化骨膜，旨在提供一种能有效促进骨膜修复和骨组织再生的三层结构骨膜及其制备方法。传统的组织工程骨膜构建方式难以重塑天然骨膜的复杂精密结构和引入微血管网络，因此难以实现功能仿生。本发明采用新颖的从下至上、从部分到整体的组合法构建了具有多重仿生功能的三层骨膜，使其能够充分模拟天然骨膜的解剖生理学特性，由底层、中层和上层叠加组成，包括具有诱导成骨能力的深面生发层、富含微血管网络且可在移植早期建立有效血供的中间基质层、以及具有生物屏障隔离作用的浅表纤维层。

2、该仿生骨膜的底层是由原料聚已内酯、丝素蛋白和铕掺杂介孔二氧化硅颗粒混合后，通过静电纺丝制成的铕掺杂介孔二氧化硅复合纳米纤维膜，简称nf-me纤维膜；并在其上接种骨髓间充质干细胞（bmscs）。通过层层叠加的方式进行仿生构建，充分模拟天然骨膜的生发层。这种层层叠加方法不仅可以精确调控每层的基质纤维组成和形貌以及细胞类型，还能有效克服传统电纺纤维支架因孔径狭小而限制细胞浸润的局限性，真实地模拟天然组织中细胞所处的三维环境。此外，支架缓释的铕离子和硅离子已被证实可显著促进bmscs生长和成骨分化，为骨再生修复提供了良好平台。

3、该仿生骨膜的中层为铕掺杂介孔二氧化硅复合胶原水凝胶层，通过将铕掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒分散在胶原溶液中制备而成，并在水凝胶内负载血管内皮细胞（vecs），简称gel-me，模拟天然骨膜中富含微血管网络的中间基质层。胶原水凝胶本身具有优异的生物相容性和生物降解性，能够提供细胞生长所需的微环境。铕元素的掺杂进一步增强了胶原水凝胶的生物活性，释放的铕离子能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，加速血管新生，从而促进仿生骨膜中微血管网络的形成，提高移植早期的血供建立效率。

4、该仿生骨膜的上层是以聚已内酯和丝素蛋白为纺丝原料的静电纺丝膜，简称nf纤维膜。其主要功能是模拟天然骨膜的浅表纤维层，作为隔离屏障，防止成纤维细胞侵入成骨区域，为骨膜提供稳定的成骨微环境。

5、本发明的高度仿生型多功能组织工程化骨膜的制备方法，具体如下：

6、s1、制备铕掺杂介孔二氧化硅颗粒，简称eu-msn颗粒；具体方法如下：

7、将氢氧化铵和十六烷基三甲基溴化铵溶于水中形成水溶液，将四乙氧基硅烷的乙醇溶液加入水溶液中，在40 ℃下搅拌5 h，然后加入六水合硝酸铕，将溶液在室温下静置过夜，得到的沉淀物干燥后，在600 ℃煅烧6 h，得到eu-msn颗粒。

8、s2、将eu-msn颗粒分散在六氟异丙醇中获得均匀的悬浮液，然后将聚已内酯（pcl）和丝素蛋白（sf）溶于悬浮液中，搅拌均匀，得到纺丝溶液；然后进行静电纺丝，制得铕掺杂介孔二氧化硅复合纳米纤维膜，简称nf-me纤维膜。

9、静电纺丝的方法是：在通风橱中将20g针头安装于5 ml注射器上并吸取电纺溶液，排净针头内空气后，将注射器固定于供液泵上，连接高压电源。静电纺丝参数设置为：环境温度30±1℃、环境湿度30±2%、15 kv电压、11 cm接收距离和1.5 ml/h的供液速度，裁取适当尺寸的锡箔纸铺展在收集板上，收集电纺纳米纤维膜。将得到的纤维膜置于乙醇中浸泡10 min，以诱导丝素蛋白构象的转变，室温通风干燥4 h。

10、s3、采用聚已内酯（pcl）和丝素蛋白（sf）为纺丝原料，按照步骤s2的静电纺丝方法，制得pcl/sf共混电纺膜，即为nf纤维膜。

11、s4、层层叠加组合法构建组织工程化仿生骨膜支架，包括以下三个子步骤：

12、s41、将骨髓间充质干细胞（bmscs）接种于nf-me纤维膜上；

13、s42、将eu-msn颗粒分散在胶原冰醋酸溶液中，用naoh调胶调节ph至6.7～7.3，该过程控制溶液温度为4 ℃，并将血管内皮细胞细胞均匀封装于胶内，然后将溶液涂覆于nf纤维膜的上表面，37 ℃静置数分钟使其微成胶，得到复合水凝胶层；

14、s43、将步骤s41获得的单片nf-me纤维膜由下至上依次叠放至少三片，然后将步骤s42获得的含有复合水凝胶层的nf纤维膜以复合水凝胶层朝下的方式叠放于nf-me纤维膜上，形成多层叠加膜。将多层叠加膜放置于37 ℃细胞培养箱中待胶原成胶后取出，再于培养基中培养24 h以上，得到组织工程化骨膜。

15、优选的是，所述eu-msn颗粒中铕与硅的摩尔比为（0.5-2）:100，简称me0.5、me1和me2。

16、优选的是，步骤s2中，聚已内酯和丝素蛋的用量质量比为4:1，eu-msn颗粒的用量是聚已内酯和丝素蛋总质量的10%。

17、优选的是，步骤s42中，冰醋酸的浓度是0.2 m，胶原溶液的浓度是6 g/l，eu-msn颗粒在胶原溶液中的浓度是5 g/l。

18、一种优选的方式，步骤s43中，形成多层叠加膜的具体方法如下：

19、（1）准备两个相同的圆环形固定件，分别为第一圆环和第二圆环，圆环两端开口的口径尺寸不同；第一圆环的大口径端的内径与第二圆环的小口径端的外径相互匹配套合；第一圆环的小口径端的内径与第二圆环的大口径端的内径同样可以相互匹配套合。

20、（2）将第一圆环小口径端向上放置，将步骤s41获得的单片nf-me纤维膜铺置覆盖在第一圆环上，由下至上依次叠放铺置至少3片，然后将步骤s42获得的nf纤维膜盖于三层叠加膜之上，然后将第二圆环的大口径端从nf纤维膜上方朝下套合固定在第一圆环的小口径端上，通过两个圆环的匹配套合，实现各层膜的固定连接，形成多层叠加膜。

21、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

22、（1）本发明中将eu-msn与聚己内酯pcl、丝素蛋白sf共混制备纳米复合电纺膜，并将单片的纳米纤维膜-干细胞层从二维平面叠加成三维立体结构，更精准地模仿体内细胞所处的复杂生理微环境，为骨髓间充质干细胞（bmscs）提供一个更为接近自然状态的生长平台，从而诱导bmscs成骨分化，模拟骨膜结构中具有成骨能力的深面的生发层；将eu-msn加入胶原凝胶，诱导内皮细胞体外预血管化，模拟具有血管网络的中间基质层；pcl/sf共混电纺膜模拟具有隔离作用的浅表层。采用层层叠加法，由下至上、从部分到整体，将每层功能性组件逐层组装成一个完整的组织工程化骨膜，充分模拟了天然骨膜的三层结构和多功能性，构建出一种高度仿生型组织工程化骨膜。该三层仿生骨膜在促进骨生长、血管生成和隔离纤维组织长入方面效果显著，适用于骨缺损修复。

23、（2）铕（eu）是一种能够促进血管生成的潜在元素，对伤口愈合和组织再生非常有利。研究发现，eu不仅具有独特的促血管生成特性，能够促进血管内皮细胞的增殖和刺激血管萌发，还能影响骨重塑周期，有助于治疗骨质疏松等骨密度疾病。本发明将eu掺入介孔二氧化硅纳米颗粒（msn）中，制备成可降解、可控离子释放的均匀纳米球，然后将其分别引入到纳米纤维膜和水凝胶中，制备出具有优异生物活性和力学性能的多层仿生骨膜，显著提高了成骨细胞和内皮细胞的增殖和分化能力。

24、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。