一种基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法与流程

本发明属于中药活性成分及作用机理研究，具体涉及一种基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，更具体涉及一种测定红花注射液中效应成分的方法。

背景技术：

1、中药有效成分的筛选是创新性药物研究的源头性工作，但中药作用的整体性、中药化学成分和作用机制的复杂性使得中药药效物质基础的评价研究进展缓慢成为制约中药现代化进程的瓶颈之一。

2、红花注射液是临床上的常用品种，是广泛用于治疗心脑血管疾病的常用中药，其主要功效是活血化瘀，用于治疗血栓性疾病，主要应用于闭塞性脑血管病、冠心病和脉管炎等疾病的预防和治疗，且经过长期的临床检验已证明其疗效确切。大量文献并结合前期研究结果显示，红花注射液有显著的抗血栓作用，且抗血小板聚集是其重要机制之一，但也仅局限于宏观药效指标或者是其中某一化学成分作用于某一靶点的研究，缺少红花注射液体内药效物质形式及抗血小板聚集效应成分的研究。

3、现代药理学研究表明，药物与细胞膜上的靶点(受体、通道、酶等)相互作用的能力是确定其在生物体内生物活性的关键步骤。基于这一观点，一种新的生物特异性提取方法被用于系统筛选中药的生物活性成分。生物色谱法是采用生物靶点选择性地结合效应成分，从而使效应成分分离，可用于活性成分的筛选和药物作用机理的研究。与传统方法相比，这种方法有两个优点：其一，从复杂的样品中分离出潜在的活性成分，对具有生物活性的中药成分分离更有效；其二，该方法不需要复杂的生物色谱柱的制备步骤，从而有效地解决了色谱柱使用寿命短，制备工艺复杂的问题。

4、作为维持体内平衡的重要生理作用，血小板表面存在多种受体和蛋白质，这就表明血小板作为一种生物材料，也可以通过它们之间的相互作用来结合和分离活性成分。血小板细胞固相萃取筛选生物活性化合物技术因完整细胞保留了细胞上靶点的完整性、空间性、周围环境及生物活性，且能够特异性地、有选择性地与活性成分结合，特别是细胞上的已知及未知的靶点都得到了表达，适合中药作用多靶点的活性成分的分离与分析。

5、目前，已有研究报道了通过生物特异性提取发现潜在活性化合物。例如，有研究采用鸡血小板生物提取与高效液相色谱分析相结合的方法，从姜中筛选血小板靶向性化学物质。在这项研究中，共鉴定出四个典型的具有抗血小板聚集作用的化合物，分别为6-姜辣素、8-姜辣素、6-生姜酚和10-姜辣素。也有研究采用人血小板对三七抗血小板聚集作用进行了研究，在与血小板膜结合的5种特征化合物中，四种鉴定为腺苷、鸟苷、人参皂苷rh1和人参皂苷f1，且结果表明核苷包括腺苷和鸟苷，主要参与了三七抗血小板聚集作用。另外，通过血小板固相色谱法发现脉络宁注射液中与血小板结合能力较强的化合物5种，分别为新绿原酸、咖啡酸、异绿原酸及它们的异构体，五种化合物中的咖啡酸能显著抑制血小板活化。再者，通过兔血小板筛选延胡索总碱中抗血小板聚集的化合物，并通过hplc-dad/lc-ms检测和鉴定了5种血小板靶向化合物，分别为海罂粟碱、脱氢紫堇碱、四氢小檗碱、四氢黄连碱和延胡索甲素。以上研究结果均表明，基于血小板细胞膜固相色谱法是筛选中药抗血小板聚集的有效方法。另外，通过调研文献发现，贾俊等人采用不同柱材料对红花注射液进行分离，将整体化学物质组拆分为5个极性不同的化学物质组，并利用血小板诱导剂adp筛选出体外具有抗血小板聚集作用的效应组。之后利用人血小板固相色谱法来筛选红花注射液效应组与红花提取物中与血小板结合的特异性成分，共鉴定出4种成分，分别为羟基红花黄色素a及其同分异构体、红花黄色素b、6-羟基山柰酚-3-o-葡萄糖苷。

6、因此，本领域期待开发更多基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药尤其是红花注射液中效应成分的方法。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述方法为抗血小板聚集活性的活血化瘀类中药注射剂的研究提供理论基础；

2、本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于血小板细胞膜固相色谱法测定红花注射液中效应成分的方法，有效解决了红花注射液大多注重宏观药效指标或者是其中某一化学成分作用于某一靶点的研究，缺少红花注射液体内药效物质形式及抗血小板聚集效应成分的研究的问题。

3、为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，包括如下步骤：

4、(1)取待测的中药和/或其制剂加入第一有机溶液混合，得到供试溶液；

5、(2)取兔全血并提取兔血小板悬液，备用；

6、(3)将所述供试溶液与所述兔血小板悬液混合孵育，经固液分离并收集已结合效应成分的血小板沉淀；

7、(4)将所述血小板沉淀加入第二有机溶液混合，经超声解离后收集上清解离液；

8、(5)采用固相萃取法对所述解离液进行预处理，得到供试样品；

9、(6)对所述供试样品进行uhplc-ms检测并分析所述效应成分。

10、具体的，所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述步骤(1)中，所述中药和/或其制剂包括中药和/或其制剂的提取物和/或提取液；

11、优选的，所述第一有机溶液包括甲醇。

12、具体的，所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述步骤(2)中，所述提取兔血小板悬液的步骤包括取兔全血加入抗凝剂混合并收集富血小板血浆的步骤，以及，经固液分离收集血小板沉淀并加入缓冲液配制悬浮液的步骤；

13、优选的，所述兔全血包括兔颈总动脉血；和/或，

14、优选的，所述抗凝剂包括枸橼酸钠；和/或，

15、优选的，所述兔全血与所述抗凝剂的质量比为8-10：1；和/或，

16、优选的，所述缓冲液包括ph7.2-7.5的pbs缓冲液。

17、具体的，所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述步骤(3)中，所述供试溶液与所述兔血小板悬液的体积比为1：1；

18、优选的，所述孵育步骤的温度为35-40℃，孵育时间20-40min；

19、优选的，所述步骤(3)还包括以等体积pbs缓冲液与所述兔血小板悬液混合配置空白对照溶液的步骤；

20、优选的，所述步骤(3)中，还包括对所述已结合效应成分的血小板沉淀进行洗脱的步骤；

21、优选的，所述洗脱步骤的洗脱溶液包括pbs缓冲液。

22、具体的，所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述步骤(4)中，所述第二有机溶液包括甲醇溶液；

23、优选的，所述超声解离步骤的温度为35-40℃，超声解离时间为20-40min。

24、具体的，所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述步骤(4)中，所述预处理步骤包括将所述解离液与固相萃取柱进行混合的步骤，并依次采用去离子水和甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液干燥至残渣并加入乙腈溶液溶解，经固液分离收集上清液，即得所需供试样品；

25、优选的，所述固相萃取柱包括spe固相萃取柱；

26、优选的，所述预处理步骤还包括加入去离子水和甲醇对所述固相萃取柱进行预激活的步骤。

27、具体的，所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述步骤(5)中，所述uhplc-ms检测步骤中，色谱条件包括：

28、色谱柱为acquity beh c18柱；

29、流动相为0.1％甲酸水溶液(a)和乙腈(b)；

30、线性梯度程序描述如下：0-2min，5-20％ b；2-27min，20-85％ b；27-30min，85％b；

31、柱温为30℃；

32、流速为0.3ml/min；

33、进样量2μl。

34、具体的，所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述步骤(5)中，所述uhplc-ms检测步骤中，以正/负离子模式进行检测，质谱条件为：

35、电喷雾离子源，喷雾电压3.5kv/-3.5kv，毛细管温度350℃，鞘气35arb，辅助气体10arb；

36、一级质谱检测采用ft全扫描模式，扫描范围m/z 100-1000，分辨率30000；

37、二级质谱检测采用数据依赖扫描，离子裂解方式为高能碰撞解离，综合碰撞能量45％；

38、采用动态排除提高二级质谱检测覆盖率，重复次数设为5，动态重复时间为30s，动态排除时间为60s；

39、低丰度化合物碎片离子信息，采用母离子表进行针对性扫描。

40、具体的，所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，所述步骤(5)中，还包括对筛选的能与血小板特异性结合的效应成分进行结构鉴定的步骤。

41、本发明还公开了一种筛选活血化瘀类中药注射液中具有抗血小板聚集活性成分的方法，包括以活血化瘀类中药注射液为原料，按照所述方法进行效应成分测定的方法；

42、优选的，所述活血化瘀类中药注射液包括红花注射液、丹参注射液或丹红注射液中的至少一种。

43、本发明所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定中药效应成分的方法，采用血小板固相萃取结合uhplc-ltq-orbitrap技术筛选中药及其制剂的效应成分，在抗血小板聚集效应成分的研究中，采用兔血小板细胞膜作为固定相，并通过优化血小板细胞膜固相色谱法条件，对进一步阐明中药尤其是活血化瘀中药制剂的作用机制具有重要参考价值和指导意义，推动中药国际化进程。

44、本发明所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定红花注射液效应成分的方法，在抗血小板聚集效应成分的研究中，采用兔血小板细胞膜作为固定相，并通过优化血小板细胞膜固相色谱法条件，鉴定出的红花注射液中效应成分更多。红花注射液体外孵育兔血小板30min，初步筛选出8个效应成分，经质谱鉴定，除已报到的羟基红花黄色素a外，首次得到7个化学成分，分别为鸟苷、l-苯丙氨酸、3-吲哚甲醛、(8z)-癸烯-4,6-二炔-o-d-葡萄糖苷及其同分异构体、山柰酚-3-o-β-d-葡萄糖苷、柚皮素。其中相关文献报道，鸟苷、(8z)-癸烯-4,6-二炔-o-d-葡萄糖苷、柚皮素均有不同程度的抗血小板聚集作用，与本实验通过血小板细胞膜固相色谱法筛选出红花注射液的效应物质相一致，也从另一角度证明该方法的可行性。至于其他三种化学成分(l-苯丙氨酸、3-吲哚甲醛和山柰酚-3-o-β-d-葡萄糖苷或同分异构体)的抗血小板聚集活性有待进一步验证。

45、本发明所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定红花注射液效应成分的方法，运用质谱技术，从灵敏度、精准度等方面来讲都有很大程度的提高，能够实现高效准确地鉴定活性组分。本发明基于完整细胞保留了细胞膜上靶点的完整性、空间性、周围环境及生物活性且能够特异性地、有选择性地与活性成分结合，特别是细胞膜上的已知及未知的靶点都得到了表达，适合中药作用多靶点的活性成分的分离与分析。本方法的建立有望在一定程度上作为现行红花注射液药效物质研究发展开创新的思路，为中药药效成分评价方法的建立提供新的研究思路，本研究对于深入研究红花注射液的药效物质基础具有重要意义，也为活血化瘀类中药中活性成分的研究提供有效方法。

46、本发明所述基于血小板细胞膜固相色谱法测定红花注射液效应成分的方法，基于uplc超高效液相色谱技术，其与传统hplc相比，具有更高的分离效率、更短的分离时间和更少的溶剂消耗，能够快速、高效地分离草药中的复杂混合物，测定效果更准确。