SEC14L3在肝癌细胞铜死亡中的应用

本发明属于生物医药领域，涉及sec14l3在肝癌细胞铜死亡中的应用。

背景技术：

1、原发性肝癌是全球第六大常见和第三大致命癌症，原发性肝癌包括了肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)(占75％-85％)、肝内胆管癌(intrahe paticcholangiocarcinoma，icc)(占10％-15％)以及其他罕见类型。肝细胞癌是原发性肝癌主要的病理类型，由于饮食、经济和科技水平等因素的不同，不同地区hcc发病率也存在较大差异，其5年存活率仅为18％。hcc主要的高危因素包括慢性病毒性肝炎、黄曲霉素接触、大量饮酒和非酒精性脂肪肝病(non alcoholic fatty liver disease，nafld)等。在大多数高危发病地区，特别是发展中国家，慢性乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)感染和黄曲霉素接触是主要的病因。

2、铜在多种生物过程中起着重要的作用，其作为各种关键代谢酶的催化辅助因子广泛参与能量转换和细胞内呼吸等重要生理过程。细胞内铜的浓度根据代谢需求和环境变化而动态调节，而铜代谢的失衡会造成细胞损害。铜死亡(cu prop tosis)是是一种铜诱导的、有别于凋亡、自噬、铁死亡和程序性坏死的新细胞死亡方式，铁氧还蛋白1(ferredoxin1，fdx1)是铜死亡的最关键调控因子。铜死亡的机制为利用强效铜离子载体(例如伊利司莫(elesclomol，es))将铜离子转运至细胞内，后者直接与三羧酸循环(tricarboxylic acidcycle，tca)途径中的硫辛酰化(lipoylation，lip)蛋白，如硫辛酰化的二氢硫辛酸转乙酰化酶(lip-dihydrolipoamide transacetylase，lip-dlat)，导致lip-dlat寡聚化和功能缺失，并干扰呼吸链复合体中的铁硫簇蛋白的功能，引起蛋白质毒性应激反应，最终导致细胞死亡。铜死亡最显著的特征和标志是二氢硫辛酸转乙酰化酶的硫辛酰化(lip-dlat)及cu+与lip-dlat结合引起的lip-dlat寡聚化并最终导致细胞的死亡。

3、现有技术中通过全基因组敲除筛选出10个铜死亡相关基因(cu proptosis-related genes，crgs)，其中7个基因敲除后可缓解铜死亡，这些基因可分为三组，即上游的关键调控因子铁氧还蛋白1(ferredoxin 1，fdx1)、硫辛酸途径相关蛋白(脂酰合成酶(lipoyl synthase，lias)、脂多转移酶1(lipolyt ransferas 1，lipt1))和编码丙酮酸脱氢酶复合物的基因(二氢脂酰胺脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase，dld)、dlat、丙酮酸脱氢酶e1亚基α1(pyruvate dehydrogenase e1 subunit alpha 1，pdha1)、丙酮酸脱氢酶e1亚基β(pyruvate dehydrogenase e1 subunit beta，pdhb))。此外，金属调节转录因子1(metal-regulatory transcription factor 1，mtf1)、谷氨酰胺酶(glutaminase，gls)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物2a(cyclin-de pendent kinase inhibitor 2a，cdkn2a)也被证明与细胞对铜的敏感性相关，三者在铜死亡过程中下调。

4、大量的研究结果表明，调控肿瘤细胞中的铜是一种具有潜在应用前景的癌症治疗方法，因而深入研究铜死亡调控hcc发生和发展的潜在机制具有重要的意义。然而目前的研究主要集中在通过生物信息学分析crgs在多种癌症中的表达和预后关系，然而其具体的调控机制尚未有充分的研究。因此，有必要进一步深入研究肝癌铜死亡的生物学机制，同时明确新的生物标志物和药物靶点，制定更有效的防治策略。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中hcc所存在的发病机制复杂、难以明确、治疗预后不佳等问题，从而对hcc的机制进行了深入研究，明确了sec14l3是与肝癌细胞铜死亡相关的重要靶点，sec14l3可通过erk1/2-yy1信号轴促进铜死亡关键基因fdx1的表达，后者将细胞中的cu2+还原成cu+，同时诱导dlat硫辛酰化；最后cu+结合lip-dlat并发生lip-dlat寡聚化，最终诱导细胞发生铜死亡，从而抑制肝细胞癌的发生和发展，为肝癌治疗方案提供新的策略。

2、为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

3、本发明第一方面提供了sec14l3在制备促进肿瘤细胞铜死亡和/或改善与铜死亡相关的生理指标的产品中的应用。

4、作为优选地，所述与铜死亡相关的生理指标选自lip-dlat水平、寡聚化li p-dlat水平中的一种或多种。

5、作为优选地，sec14l3通过调控fdx1的表达以促进肿瘤细胞铜死亡。

6、作为优选地，sec14l3通过mapk-erk1/2-yy1信号轴调控fdx1的表达以促进肿瘤细胞铜死亡。

7、作为优选地，所述肿瘤细胞选自肝癌细胞。

8、本发明第二方面提供了sec14l3在制备提高铜死亡诱导剂对癌症治疗敏感性的产品中的应用。

9、作为优选地，所述铜死亡诱导剂选自伊利司莫、双硫仑、nsc319726中的一种或多种。

10、作为优选地，所述癌症选自肝癌。

11、本发明第三方面提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，包括sec14l3活性剂、铜死亡诱导剂，以及药学上可接受的辅料；所述sec14l3活性剂包括sec14l3核苷酸、sec14l3蛋白、促进sec14l3表达的试剂中的一种或多种。

12、作为优选地，所述铜死亡诱导剂选自伊利司莫、双硫仑、nsc319726中的一种或多种。

13、作为优选地，所述癌症选自肝癌。

14、作为优选地，所述药学上可接受的药用辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、防腐剂、抗氧剂、着色剂中的一种或多种。

15、应理解的是，在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，所述sec14l3或sec14l3活性剂包括了sec14l3核苷酸、sec14l3核苷酸所编码的sec14l3蛋白以及其他能够提高细胞内sec14l3表达水平的成分，只要能够实现sec14l3水平和/或活性提高即可。所述sec14l3抑制剂是指能够特异性下调sec14l3表达水平和/或其成熟mrna的转录水平和/或sec14l3蛋白表达水平或活性的物质，例如采用反义寡核苷酸、sirna、shrna、sgrna、antagomirs、mirna海绵、mir na erasers、target masking和/或多靶点等方法以下调sec14l3表达水平和/活性，只要是能够实现sec14l3的水平和/或活性降低均可。所述引物和/或引物对是指用于在pcr中合成sec14l3基因cdna链的pcr引物，从而用于检测sec14l3基因mrna的表达水平。除本发明所列出的引物和/或引物对外，本领域技术人员完全有能力根据sec14l3的基因序列采用包括但不限于分子生物学等本领域的常规方法手段进行相应引物和/或引物对的设计，并通过常规实验手段对所设计的引物和/或引物对进行筛选，只要能够实现特异性检测sec14l3表达水平即可；亦可以采用本领域的常规试剂和方法对sec14l3蛋白表达水平进行检测。

16、sec14l3是一种非典型iii类磷脂酰肌醇转移蛋白(atypical class iiiphosphatidylinositol transfer proteins，pitps)，该基因定位于染色体22q12，其编码蛋白包含3个结构域，即结合亲脂性小分子的n端cral-trio结构域、疏水性配体结合口袋的sec14结构域及促进蛋白质-蛋白质相互作用的c端gold结构域。生理状态下sec14l3可作为转运体促进膜之间磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱的交换，以维持膜脂水平的平衡。近年研究发现，sec14l3表达异常可能与人类疾病(如哮喘等)发生相关，但sec14l3在hcc发生中的作用及机制尚未见报道。

17、本发明经过大量深入研究，首先在癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，tcga)数据库中通过生物信息学分析sec14l3与hcc发生发展的关系，结果发现sec14l3在hcc中显著低表达，低表达sec14l3的hcc恶性程度更高，并且低表达sec14l3显著影响hcc患者的生存预后。gsea分析显示，sec14l3与mapk通路活性相关，并且sec14l3与铜死亡关键基因fdx1的表达呈显著正相关。这表明了sec14l3可能调控hcc的mapk通路活性，从而影响fdx1表达。

18、随后的体内外实验发现，sec14l3在三种肝癌细胞株中的表达水平显著低于正常肝细胞的表达水平，并且其在46例肝细胞癌组织中的表达也显著低于其配对的癌旁非肿瘤组织。接下来，发现过表达sec14l3以铜离子剂量依赖的方式显著抑制了肝癌细胞的生长，并且显著增加了lip-dlat水平和寡聚化lip-dlat水平，而sec14l3敲低则显著促进了肝癌细胞的生长，并且显著降低了lip-dla t水平和寡聚化lip-dlat水平。这些结果表明sec14l3在hcc的发生和发展中发挥重要作用，并且sec14l3通过促进铜死亡抑制了肝癌细胞生长。

19、进一步地，本发明对sec14l3通过铜死亡调控肝癌细胞生长的潜在机制进行深入分析。结果发现，铜死亡关键基因fdx1在三种肝癌细胞中的表达水平显著低于正常肝细胞的表达水平；此外，过表达sec14l3显著降低了p-erk1/2水平，而sec14l3敲低则显著增加了p-erk1/2水平；进一步，发现抑制p-erk1/2降低了yy1的表达水平并通过降低yy1在fdx1启动子上的富集水平，进而促进了fd x1的表达水平；而激活p-erk1/2可促进yy1的表达水平并通过增加yy1在fdx 1启动子上的富集水平，进而降低了fdx1的表达水平。以上结果表明sec14l3可通过erk1/2-yy1信号轴正向调控铜死亡关键基因fdx1的表达。本发明首次揭示了sec14l3通过介导erk/12-yy1信号轴促进铜死亡关键基因fdx1的表达。

20、更进一步地，本发明对sec14l3及erk/12-yy1-fdx1信号轴调控铜死亡抑制肝癌细胞生长的作用机制进行了深入研究。结果发现，在es和铜离子的作用下，过表达sec14l3显著抑制了肝癌细胞的生长，并显著增加了lip-dlat水平和寡聚化lip-dlat水平；而在此基础上激活erk1/2活性则显著促进了肝癌细胞的生长，并显著降低了lip-dlat水平和寡聚化lip-dlat水平；而进一步联合过表达fdx1则显著恢复了肝癌细胞的生长抑制，并显著增加了lip-dlat水平和寡聚化lip-dlat水平。此外，在es和铜离子的作用下，sec14l3敲低显著促进了肝癌细胞的生长，并显著降低了lip-dlat水平和寡聚化lip-dlat水平；而在此基础上抑制erk1/2活性则显著抑制了肝癌细胞的生长，并显著增加了lip-dlat水平和寡聚化lip-dlat水平；而进一步联合fdx1敲低则显著恢复了肝癌细胞的生长活力，并显著降低了lip-dlat水平和寡聚化lip-dlat水平。以上结果表明，sec14l3通过erk/12-yy1-fdx1信号轴促进铜死亡抑制肝癌细胞生长，进一步证实了sec14l3介导的铜死亡能够成为新的肝癌治疗方向。

21、总的来说，本发明通过生物信息学分析及一系列体内外实验，首次发现并明确了sec14l3通过调控铜死亡从而抑制肝细胞癌生长，并深入研究了其作用机制，即sec14l3通过erk1/2-yy1信号轴促进铜死亡关键基因fdx1的表达，后者将细胞中的cu2+还原成cu+，同时诱导dlat硫辛酰化(lip-dlat)；最后cu+结合li p-dlat并发生lip-dlat寡聚化，最终诱导细胞发生铜死亡，从而抑制肝细胞癌的发生和发展。本发明丰富了铜死亡调控的相关机制，对于探寻新的肝细胞癌诊断、预后判定及治疗分子靶标、开发新的靶向药物提供了充分的科学依据和理论基础，具有重要的社会价值和科学意义。