一种以效应为导向的水体中激素及其疑似内分泌干扰物的检测方法与流程

本发明涉及环境保护，具体涉及一种以效应为导向的水体中激素及其疑似内分泌干扰物的检测方法。

背景技术：

1、内分泌干扰物是一种外源性物质，干扰生物体内维持自稳定性、调节生殖发育和其他行为的荷尔蒙的合成、分泌、输送、结合、作用和排泄。内分泌干扰物主要关注雌激素类(抗雌激素)、雄激素类(抗雄激素)、孕激素类、糖皮质激素类、烷基酚类和甲状腺干扰物等。雌激素类、雄激素类、孕激素类和糖皮质激素类污染物作为常见的类固醇激素，会不可避免的在生产和使用过程中被排放至环境，其对水生生态系统及人类健康造成的威胁已经受到了关注。

2、由于水环境中痕量存在的激素类物质对生物易造成内分泌干扰现象，因此，需要建立水环境中激素的分析方法，进一步对水环境中的激素的浓度进行控制，进而减少对生物体的内分泌的干扰。中国专利cn109856266a中公开了同时测定环境水样中多种痕量盐/糖皮质激素的分析方法，具体的步骤包括，(1)环境水样的预处理：将水样过滤后再经固相萃取柱进行萃取处理；(2)使用高效液相色谱质谱串联技术对步骤(1)中处理后的样品进行检测；(3)绘制标准曲线，并以外标法进行定量测定，通过换算得到环境水样中盐/糖皮质激素的含量。采用该专利中的方法能够检测到21种糖皮质激素和3种盐皮质激素，检测到的激素较少。

技术实现思路

1、本发明提供了一种以效应为导向的水体中激素及其疑似内分泌干扰物的检测方法，结果准确，可一次性检出69种激素，包括雄激素、雌激素、糖皮质激素及孕激素，且样品处理简单，适用于大批量样品。

2、为实现上述技术目的，本发明提供了一种水体中激素的检测方法，包括以下步骤：

3、s1、供试品溶液和激素对照品溶液的制备；

4、s2、采用超高效液相色谱串联质谱的方法对供试品溶液和激素对照品溶液进行检测，采用外标法测定供试品溶液中激素的含量；色谱条件包括，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含氟化铵的水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱：

5、 时间/min 流动相a/％ 流动相b/％ 0-2 70 30 2-8 70→2 30→98 8-10 2 98 10-10.1 2→70 98→30 10.1-12.1 70 30

6、。

7、进一步地，s1步骤中，所述供试品溶液的制备方法包括对待测水样进行过滤、富集的步骤；优选的，所述富集的步骤中包括采用填料为亲水-亲油平衡树脂的柱子对待测水样中的成分进行固定、采用洗脱剂洗脱、浓缩和复溶；更优选的，所述洗脱剂为体积比为40-60:40-60的乙酸乙酯和甲醇的混合物；更优选的，所述复溶的溶剂为体积百分浓度为10-50％的甲醇水溶液或乙腈水溶液。

8、进一步地，激素对照品溶液的溶剂选自甲醇、乙腈、水中的一种或多种；和/或，所述激素对照品溶液的浓度为0.1-80μg/l；和/或，色谱柱的规格为2.1×100mm，2.2μm；和/或，柱温为35-40℃；和/或，流速为0.1-0.3ml/min；和/或，进样体积为8-11μl；和/或，所述含氟化铵的水溶液的浓度为0.01-0.1mm。

9、进一步地，所述质谱的电离模式选自正离子和/或负离子；和/或，喷雾电压为2.0-3.5kv，离子传输管的温度为200-350℃，喷雾锥的温度为200-350℃，鞘气的流量为10-50arb，辅助气的流量为10-20arb，反吹气的流量为0-10arb。

10、进一步地，所述激素对照品选自糖皮质激素、雄激素、孕激素、雌激素中的一种或多种；优选的，所述糖皮质激素选自泼尼松、可的松、泼尼松龙、氢化可的松、甲基泼尼松龙、氟米龙、倍他米松、地塞米松、醋酸泼尼松、醋酸可的松、泼尼松龙醋酸酯、醋酸氢化可的松、倍氯米松、氟米松、甲基泼尼松龙醋酸酯、氟米龙醋酸酯、醋酸氟氢可的松、布地奈德、丁酸氢化可的松、曲安奈德、醋酸倍他米松、地塞米松醋酸酯、氟氢缩松、地夫可特、戊酸氢化可的松、哈西奈德、丙酸氯倍他索、醋酸曲安奈德、倍他米松戊酸酯、曲安西龙双醋酸酯、丁酸氯倍他松、泼尼卡酯、醋酸氟轻松、醋酸双氟拉松、氟替卡松丙酸酯、安西奈德、倍他米松二丙酸酯、阿氯米松双丙酸酯、丙酸倍氯米松、糠酸莫米松中的一种或多种；优选的，所述雄激素选自群勃龙、诺龙、勃地酮、雄烯二酮、睾酮、美雄酮、甲睾酮、康力龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙中的一种或多种；优选的，所述孕激素选自炔诺酮、左炔诺孕酮、黄体酮、甲地孕酮、甲羟孕酮、炔诺肟酯、醋羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮中的一种或多种；优选的，所述雌激素选自己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌酚酮、17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、苯甲酸雌二醇中的一种或多种。

11、所述外标法为标准曲线法。

12、进一步地，在进行s2步骤前还包括对供试品溶液进行内分泌干扰效应检测的步骤；优选的，所述内分泌干扰效应的检测方法选自雌激素受体结合试验、雄激素受体结合试验、孕激素受体结合试验、糖皮质激素受体结合试验中的一种或多种；更优选的，所述雌激素受体结合试验的方法为化学激活荧光素酶基因表达法。

13、进一步地，所述雌激素受体结合试验中包括：

14、(1)检测阳性对照品溶液处理的mvln细胞的荧光强度；

15、(2)检测供试品溶液处理的mvln细胞的荧光强度并计算相对荧光强度；

16、(3)判断供试品溶液是否具有雌激素受体结合效应；

17、优选的，还满足以下a-e中的一项或多项：

18、a、所述阳性对照品溶液的浓度为4800-5200pm；

19、b、所述阳性对照品溶液中的溶剂为饥饿培养基；

20、c、所述阳性对照品为17-β-雌二醇；

21、d、当供试品溶液的相对荧光强度＞50％时，则供试品溶液具有雌激素受体结合效应；

22、e、所述供试品溶液检测前还包括采用二甲基亚砜进行溶剂置换的步骤；更优选的，供试品溶液与二甲基亚砜的体积比为1.5:0.18-0.22。

23、mvln细胞：通过将荧光素酶基因(luc)连接在雌激素受体(er)后，构建质粒，并稳定转入人乳腺癌细胞mcf-7，获得mvln细胞株。

24、雌激素受体结合试验原理：将mvln细胞暴露于外源具有雌激素效应的物质，该物质与er结合后，可触发下游荧光素酶的表达。荧光素酶催化底物荧光素(luciferin)生成氧化性荧光素(oxyluciferin)，同时发出生物荧光。通过酶标仪测定荧光素氧化过程中生物荧光的变化，评价er的结合情况，从而评价物质是否具有雌激素受体结合效应。

25、进一步地，供试品溶液的荧光强度与阳性对照品溶液的荧光强度的比值为相对荧光强度；优选的，将供试品溶液或阳性对照品溶液的荧光强度采用溶剂对照品溶液的荧光强度进行校正；更优选的，所述溶剂对照品溶液包括二甲基亚砜的体积百分含量为0.09-0.11％的二甲基亚砜-饥饿培养基溶液。

26、进一步地，在进行雌激素受体结合试验前还包括对供试品溶液进行细胞毒性检测，收集细胞存活率＞75％的供试品溶液进行雌激素受体结合试验。

27、进一步地，所述检测的方法还包括采用超高效液相色谱串联质谱的方法对供试品溶液进行疑似内分泌干扰物的检测；优选的，还满足以下a-d中的一项或多项：

28、a、以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸水溶液或水为流动相a，以甲醇为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱：

29、 时间/min 流动相a/％ 流动相b/％ 0-2 95％ 5％ 2-4.5 95％→5％ 5％→95％ 4.5-5.5 5％ 95％ 5.5-9.5 5％→95％ 95％→5％ 9.5-13 95％ 5％

30、；

31、更优选的，所述甲酸水溶液的体积百分浓度为0.1-0.3％；

32、b、所述疑似内分泌干扰物选自2-羟基-4-正辛氧基二苯甲酮、吡喹酮、去氢表雄酮、17-硫酸睾酮、2-萘磺酸、三正丁基氧化膦、硫酸单十二烷基酯、4-十二烷基苯磺酸、八乙二醇、皮诺敛酸、亚氨基(甲基)苯基-4-磺酸2,4,6-三甲基苯磺酸、10-(4-磺苯基)癸酸中的一种或多种；

33、c、喷雾电压为2-3.5kv，离子传输管温度为200-350℃，喷雾锥温度为200-350℃，鞘气的流速为10-50arb，辅助气的流速为10-20arb，反吹气的流速为0-10arb；

34、d、流速为0.3ml/min，柱温为35-40℃。

35、本发明还提供一种上述水体中激素的检测方法在环境水体检测中的应用。

36、本发明的技术方案具有以下有益效果：

37、(1)本发明提供的一种水体中激素的检测方法，包括以下步骤：s1、供试品溶液和激素对照品溶液的制备；s2、采用超高效液相色谱串联质谱的方法对供试品溶液和激素对照品溶液进行检测，采用外标法测定供试品溶液中激素的含量；色谱条件包括，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含氟化铵的水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b进行梯度洗脱。在本发明的检测方法下，可一次性检出69种激素，包括雄激素、雌激素、糖皮质激素及孕激素，且响应高，结果准确。

38、(2)本发明提供的一种水体中激素的检测方法，通过在s2步骤前增加对供试品溶液进行内分泌干扰效应的检测的步骤，可在大量水样中选择具有内分泌干扰效应的水样进行激素的定性定量分析，减少了水样的检测量，进而缩短了检测时间，为内分泌干扰物的监管提供了方法和依据。

39、(3)本发明提供的一种水体中激素的检测方法，通过采用超高效液相色谱串联质谱的方法对供试品溶液进行疑似内分泌干扰物的检测，得到12种疑似内分泌干扰物，进一步为水污染治理提供了新的目标化合物。