一种人脐带间充质干细胞冻存液及其应用的制作方法

本发明涉及间充质干细胞保存，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞冻存液及其应用。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stem cell,msc)来源于发育早期的中胚层，是具有高度自我更新能力，高度增殖能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织中。其中脐带中的msc含量丰富，功能更强，成为msc研究的重要来源。然而，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，huc-msc)过度传代培养会出现严重的衰老和凋亡，且长期体外培养容易发生自发分化，失去多分化潜能，造成huc-msc资源的浪费。

2、目前，普遍采用低温冻存的方式对huc-msc进行保存，条件一般是先梯度降温至-80℃，然后浸入-196℃的液氮中保存。王军等采用该条件对huc-msc进行冻存，同时采用含10％dmso、40％fbs的dmem/f12培养基作为冻存液，冻存6个月后复苏huc-msc，测定存活率为96.57％，与冻存前的97.32％相比，差异不大。(参见王军,孔维霞,徐曼,等.低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响[j].军医进修学院学报,2012,33(11):5.doi:10.3969/j.issn.1005-1139.2012.11.021.)。但是，该方法的冻存时间较短，只有6个月，难以满足实际生产所需。然而冻存液关乎着huc-msc的冻存时间和冻存活性。李田等采用不同的冻存液对huc-msc进行保存，冻存时间可以延长到12个月，但即使采用最优的冻存液，复苏后细胞存活率也只能达到85％左右。(参见李田,李小毛,陈少宏,et al.不同冻存液对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响[j].器官移植,2013,4(5):6.doi:10.3969/j.issn.1674-7445.2013.05.006.)。因此，有必要对huc-msc的冻存液进行优化，以更好的保存huc-msc的功能。

3、中药是中华民族的瑰宝，有着数千年的使用历史，其中植物药占大多数。随着研究的深入，中药的使用已然不再局限于治病救人。中药提取物是以中药原料为基础经过溶剂提取浓缩到的“精华”，含有多种活性成分，且功能广泛。汪艳等就利用黄芪提取物冷冻保存原代人胎肝细胞([1]汪艳,朱应乾,林敬明,等.黄芪提取物对冷冻保存原代人胎肝细胞的保护作用[j].中药材,2007,30(012):1551-1554.doi:10.3321/j.issn:1001-4454.2007.12.023.)。因此，开发植物提取物对人脐带间充质干细胞的冷冻保护作用是可行的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞的冻存液，解决冻存时间短以及冻存后的huc-msc存活率低的问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种人脐带间充质干细胞冻存液，包括基础培养基和植物提取物；

4、所述基础培养基包括dmem/f12、dmso和pbs，所述dmem/f12、dmso和pbs的体积比为40～60:5～10:30～50；

5、所述植物提取物为黄芩提取物或车前子提取物。

6、优选的，所述黄芩提取物的添加量为所述基础培养基体积的5～20mg/l。

7、优选的，所述车前子提取物的添加为所述基础培养基体积的50～70mg/l。

8、优选的，所述黄芩提取物或车前子提取物的制备方法，包括如下步骤：

9、(1)取黄芩干燥根或干燥车前子加水浸泡，浸泡结束后滤除水份，研磨，得到黄芩粉浆或车前子粉浆；

10、(2)取黄芩粉浆或车前子粉浆加水煎煮，固液分离，得到滤液；

11、(3)滤液浓缩后烘干，得到黄芩提取物或车前子提取物。

12、优选的，所述加水浸泡的加水量为黄芩干燥根或干燥车前子质量的5～10倍；所述浸泡的时间为6～8h。

13、优选的，所述加水煎煮时，黄芩粉浆或车前子粉浆与水的体积比为1:3～5，所述煎煮的时间为30～60min。

14、本发明还提供了一种所述的冻存液在冻存人脐带间充质干细胞中的应用。

15、本发明提供的人脐带间充质干细胞的冻存液在基础冻存培养基的基础上，添加了植物提取物，尤其是添加的黄芩提取物和车前子提取物提高了huc-msc存活率，延长了huc-msc的冻存时间。解决了huc-msc冻存时间短以及冻存后存活率低的问题。

技术特征：

1.一种人脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括基础培养基和植物提取物；

2.如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述黄芩提取物的添加量为所述基础培养基体积的5～20mg/l。

3.如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述车前子提取物的添加为所述基础培养基体积的50～70mg/l。

4.如权利要求2或3所述的人脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述黄芩提取物或车前子提取物的制备方法，包括如下步骤：

5.如权利要求4所述的人脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述加水浸泡的加水量为黄芩干燥根或干燥车前子质量的5～10倍；所述浸泡的时间为6～8h。

6.如权利要求5所述的人脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述加水煎煮时，黄芩粉浆或车前子粉浆与水的体积比为1:3～5，所述煎煮的时间为30～60min。

7.一种权利要求1～6任一项所述的冻存液在冻存人脐带间充质干细胞中的应用。

技术总结本发明提供了一种人脐带间充质干细胞冻存液及其应用，属于间充质干细胞保存技术领域。本发明提供的人脐带间充质干细胞冻存液，包括基础培养基和植物提取物；所述基础培养基包括DMEM/F12、DMSO和PBS，所述DMEM/F12、DMSO和PBS的体积比为40～60:5～10:30～50；所述植物提取物为黄芩提取物或车前子提取物。本发明提供的人脐带间充质干细胞冻存液在基础冻存培养基的基础上添加植物提取物，提高了hUC‑MSC存活率，延长了hUC‑MSC的冻存时间。技术研发人员：杨业国,苏晓萍,侯海燕,王仕米,邓佐成,王禹,何东迅受保护的技术使用者：广东壹加再生医学研究院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2