一种茶叶中小檗碱残留量的测定方法

本发明涉及一种茶叶中小檗碱残留量的测定方法，属于茶叶中小檗碱残留量的检测。

背景技术：

1、小檗碱(berberine)，亦称黄连素，黄色针状结晶，味苦，是从中药黄连中分离的一种季铵型异喹啉类生物碱，是黄连抗菌的主要有效成分，在植物界中分布较广，大约有4个科10个属内发现有小檗碱存在。

2、茶树病害中包括各种病原菌引起的病害，如茶炭疽病、茶根腐病、茶叶灰霉病、茶芽枯病、茶饼病、茶轮斑病、茶白星病等。为防治茶树病害。

3、小檗碱对引起茶树茶云纹叶枯病的炭疽菌有明显的抑菌效果。有研究表明小檗碱对于5种不同茶树炭疽菌colletotrichumcamelliae、c.chongqingense、c.gloeosporioides、c.karstii、c.fioriniae均具有较好的抑菌活性，但对不同炭疽菌种表现出明显的差异性，在小檗碱质量浓度为12.0mg·ml-1时，两种炭疽菌的菌落生长完全被抑制，达到100％的抑菌效果，对其他三种炭疽菌的抑菌效果分别为85.51％、84.31％、89.58％。小檗碱在茶树妨害时的使用，会不可避免地在茶叶中残留。小檗碱对人体胃肠道有一定的刺激作用，有可能会出现烧心、反酸、纳差、腹胀、腹痛、恶心、呕吐，严重的有可能会出现腹痛腹泻，也有些人群会出现小檗碱过敏反应，出现局部皮肤发红、瘙痒、皮疹、血管神经性水肿的改变。研究茶叶中小檗碱残留量，控制茶叶质量，对人体健康具有重要的现实意义。

4、食品中农药最大残留限量gb2763-2021中没有小檗碱的检测方法，本技术提供一种生物杀菌剂小檗碱在茶叶中的残留量的测定方法，填补了现有空白，在控制茶叶质量的同时，可以扩展小檗碱抑菌对于茶树病害防治方面的认识。

技术实现思路

1、本发明提供一种茶叶中小檗碱残留量的测定方法，使用高效液相色谱法(hplc)测定茶叶中生物杀菌剂小檗碱残留量，简单，可靠，准确，精度高，稳定性好，填补了现有茶叶中小檗碱残留量测定的空白。

2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种茶叶中小檗碱残留量的测定方法，将待测茶叶粉碎，利用5％甲酸+甲醇溶液提取后，置于装有n-丙基乙二胺(psa)填料和无水硫酸镁的quechers净化管中净化，再用0.45μm滤膜过滤后，按照如下色谱条件测试：

4、色谱柱：agilent5hc-c18(2)250×4.6mm(pn588905-902，sn566626)；

5、流动相：a为ph＝3～3.5的0.02％甲酸水溶液，b为乙腈；

6、梯度洗脱：0～10min，90％a→75％a；10～15min，75％a→55％a；15～20min，55％a→30％a；20～21min，30％a→90％a；21～24min，90％a；

7、流速：0.8～1.2ml/min；

8、检测波长：265nm；

9、柱温：20～30℃；

10、进样量：4～5μl。

11、上述梯度洗脱过程中，流动相a和流动相b总和是100％，如，0～10min，90％a→75％a，也即0～10min：流动相a为90％到75％，流动相b为10％到25％。其余类似表达含义类似。

12、在茶叶中小檗碱残留量的测定的过程中，提取剂的选择、净化柱的选择、色谱条件的选择都非常重要：

13、关于提取剂的选择：提取剂的选择非常关键，由于茶叶自身还有含有很多不同的物质，并不能简单的通过溶剂的溶解性来选择提取剂，如：若采用溶解性很强的乙腈及其水溶液，没有在目标峰位置出峰，响应值基本没有，即便改变保留时间，也同样；若采用碱性试剂，则峰面积都很小，峰高相差不大，提取效果差；若采用盐酸+甲醇溶液，效果也差。甲酸+甲醇溶液的浓度也会对结果有明显影响，浓度过小，影响提取效果，过大影响色谱柱；

14、关于净化柱的选择：若不净化，则基线很不平稳，波动大，检出的杂质峰多；而若采用cleanertmas-q系列固相萃取spe柱(psa400mg、c18 400mg、pc 400mg、mgso41200mg)、quechers净化管(400mgpsa、200mggcb、400mgc18、1200mgmgso4)等，则会出现响应值极低、峰面积小、杂质峰多等问题，本技术采用置于装有n-丙基乙二胺填料和无水硫酸镁的quechers净化管，psa协同硫酸镁，净化了茶叶本身的杂质和影响测定的物质，适于茶叶中小檗碱残留检测；

15、关于色谱条件的选择：不同流动相的检测效果差异甚大，如：若采用磷酸二氢钾–乙腈，则色谱峰出现峰分离度低、拖尾的状况，且出峰时间久，峰响应值不高，标准溶液的谱图看出还有其他溶剂峰的干扰，无法准确判断，即便调节ph，也无法解决前述问题；若采用0.1％甲酸水溶液–0.1％甲酸甲醇溶液，则虽响应值较高，但出峰时间较久，目标峰分离效果差；若采用水相–甲醇相，则无响应；若采用甲酸或磷酸–甲醇，则峰形分不开、分离效果差；同时流动相的不同ph也很关键，否则会出现色谱峰拖尾的情况。波长的选择同样也很关键，过大或过小都会影响检测，如：若采用345nm波长，则会出现目标峰响应值不够高，在基线附近波动起伏大等问题；若采用220nm波长，也会出现基线不平稳，波动较大等问题。包括色谱柱、洗脱程序等选择均非常关键，均直接影响检测的稳定性和准确性。

16、本技术5％甲酸+甲醇溶液，即取5ml甲酸用甲醇定容至100ml并混匀而成。其余类似表达，含义类似。

17、作为一种具体的实现方案，茶叶中小檗碱残留量的测定方法，包括如下步骤：

18、1)将待测茶叶粉碎，置于5％甲酸+甲醇溶液中，震荡摇匀，涡旋1～2min，超声提取10～20min，4000～5000r/min离心2～3min，取上清液，得提取液；

19、2)将提取液置于装有n-丙基乙二胺(psa)填料和无水硫酸镁的quechers净化管中，涡旋3～5min，8000～10000r/min离心5～8min，转移上清液用0.45μm滤膜过滤，得待测样品；n-丙基乙二胺填料与无水硫酸镁的质量比为3：(6～8)；

20、3)配置小檗碱标准溶液，并利用依次经过步骤1)和步骤2)处理的空白基质提取液稀释得到系列基质标准溶液，并按照如下色谱条件测试，绘制标准曲线；

21、色谱柱：agilent5hc-c18(2)250×4.6mm(pn588905-902，sn566626)；

22、流动相：a为ph＝3～3.5的0.02％甲酸水溶液，b为乙腈；

23、梯度洗脱：0～10min，90％a→75％a；10～15min，75％a→55％a；15～20min，55％a→30％a；20～21min，30％a→90％a；21～24min，90％a；

24、流速：0.8～1.2ml/min；

25、检测波长：265nm；

26、柱温：20～30℃；

27、进样量：4～5μl；

28、4)在步骤3)的色谱条件下检测待测样品，根据步骤3)建立的标准曲线得到待测样品中小檗碱残留量，或对待测样品中各残留药物进行定性检测。

29、上述步骤3)中，绘制标准曲线，得线性回归方程为y＝10.2808x+3.6358，相关系数r2＝0.99950；x为质量浓度，y为峰面积。

30、为了进一步提高检测准确性，将茶叶粉碎至50目以下。

31、上述5％甲酸+甲醇溶液的用量为每克茶叶20～30ml。

32、为了确保检测准确性，作为一种优选的实现方案，流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量为5μl。

33、作为一种更具体的优选实现方案，茶叶中小檗碱残留量的测定方法，包括如下步骤：

34、1)将茶叶经高速粉碎机中粉碎后过50目筛，称取茶叶粉碎试样0.2g于10ml离心管中，加入提取溶剂5％甲酸+甲醇溶液5.0ml，震荡摇匀，涡旋2min，超声提取20min，冷却，5000r/min离心3min，待净化；

35、2)样品quechers净化：取上清液4ml置于装有n-丙基乙二胺(psa)填料300mg、无水硫酸镁700mg的净化管中，涡旋5min，10000r/min离心5min；取上清液2ml到离心管中，氮吹近干，甲醇定容至1ml，用0.45μm滤膜过滤，得待测样品；

36、3)配置小檗碱标准溶液，并利用依次经过步骤1)和步骤2)处理的空白基质提取液稀释得到系列基质标准溶液，并按照如下色谱条件测试，绘制标准曲线；

37、色谱条件：

38、色谱柱：agilent5hc-c18(2)250×4.6mm(pn588905-902，sn566626)；流动相：0.02％甲酸水溶液(ph＝3.16)―乙腈；梯度洗脱程序：0～10min，90％a→75％a；10～15min，75％a→55％a；15～20min，55％a→30％a；20～21min，30％a→90％a；21～24min，90％a；流速：1.0ml/min；检测波长：265nm；柱温：30℃；进样量：5μl；

39、4)在步骤3)的色谱条件下检测待测样品，根据步骤3)建立的标准曲线得到待测样品中小檗碱残留量，或对待测样品中各残留药物进行定性检测。

40、本技术所涉及的“％”，未特别说明的均为体积百分比。

41、本发明未提及的技术均参照现有技术。

42、本发明具有如下有益效果：

43、1)本发明为生物杀菌剂小檗碱在茶叶领域防治茶树病害的残留问题提供检测方法，填补了现有茶叶中小檗碱残留量测定的空白，在控制茶叶质量的同时，可以扩展小檗碱抑菌对于茶树病害防治方面的认识。

44、2)本发明建立了高效液相色谱法(hplc)测定茶叶中生物杀菌剂小檗碱的残留量检测，小檗碱在0.01～5μg/ml范围内与峰面积的线性关系良好。

45、3)本发明可完成茶叶中小檗碱残留的定性、定量检测，在目标峰位置附近无干扰，灵敏度好，精密度高，操作简便，对多类茶叶具有普适性。