松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因MaDDHD2及其dsRNA和应用的制作方法

本发明属于森林保护学领域，具体涉及一种松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2及其dsrna和应用。

背景技术：

1、松材线虫病是目前我国发生最为严重的森林病害，对我国松林生态安全构成了严重威胁，其影响范围与危害程度逐年增加，已经成为阻碍我国林业高质量发展的主要障碍之一。松材线虫（ bursaphelenchus xylophilus）的传播依赖于媒介昆虫。在我国南方地区，松墨天牛（ monochamus alternatus）是最主要传播媒介，如何切断松墨天牛与松材线虫的共生关系，从而阻断松材线虫病的传播，是松材线虫病防控工作中重要的环节，但目前在尚无针对这个环节的有效防控手段。研究表明，松墨天牛线粒体中的脂肪酸β氧化循环与其松材线虫携带量密切相关，松墨天牛可通过 maddhd2基因调控脂肪酸β氧化途径响应松材线虫的负载。

2、本发明首次从松墨天牛体内分离出 maddhd2基因，通过基因沉默何表型分析验证了 maddhd2基因在控制松墨天牛的松材线虫携带量中起到了正调控作用。因此，本发明公开了松墨天牛的松材线虫携带量响应基因及其在松材线虫病防控方面的应用，即通过调控 maddhd2基因来开发松材线虫病防控潜在药物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2及其dsrna和应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、上述的松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2的应用，为如下任意一种或多种：

5、1）在调控松墨天牛脂肪酸β氧化速率中的应用；

6、2）在调控松墨天牛携带松材线虫能力中的应用；

7、3）在防控松材线虫中的应用。

8、进一步的，上述调控松墨天牛脂肪酸β氧化速率为通过降低松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2的表达水平降低松墨天牛脂肪酸β氧化速率。

9、进一步的，上述调控松墨天牛携带松材线虫能力为通过降低松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2的表达水平提高松墨天牛携带松材线虫能力。

10、上述的松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2的荧光定量引物对，所述荧光定量引物对的序列为：

11、正向引物：5'-tggcattcaaaattacattccga-3'，

12、反向引物：5'-cccaccattgaaactcggattt-3'。

13、上述的松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2的dsrna，所述dsrna是由seq idno.4所示的核苷酸序列和与seq id no.4所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链rna。

14、上述的dsrna的制备方法，其是根据松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因 maddhd2设计dsrna引物对并通过pcr扩增得到带有t7启动子序列的dna，以所述带有t7启动子序列的dna为模板经体外转录合成dsrna；所述带有t7启动子序列的dna的核苷酸序列如seq id no.3所示。

15、进一步的，上述dsrna引物对的序列为：

16、正义链引物：5'-taatacgactcactataggaccagctcacgttgatcaca-3'，

17、反义链引物：5'-taatacgactcactatagggaggtgaaggtttcgagggt-3'。

18、上述的dsrna的应用，为如下任意一种或多种：

19、1）在降低松墨天牛脂肪酸β氧化速率中的应用；

20、2）在提高松墨天牛携带松材线虫能力中的应用；

21、3）在防控松材线虫中的应用。

22、一种降低松墨天牛脂肪酸β氧化速率和/或提高松墨天牛携带松材线虫能力的方法，其是将上述的dsrna注射入松墨天牛体内，注射部位为松墨天牛的前胸背板。

23、本发明的优点在于：

24、本发明首次从松墨天牛体内分离得到 maddhd2基因，通过基因沉默何表型分析验证了 maddhd2基因在控制松墨天牛的松材线虫携带量中起到了正调控作用，以期利用基因工程手段减少松墨天牛携带松材线虫的数量，切断松材线虫病的传播途径，同时减少松材线虫病防控过程中各种有毒有机挥发性化学药剂的使用，减少对环境的污染。

技术特征：

1.松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因maddhd2，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.权利要求1所述的松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因maddhd2的应用，其特征在于：为如下任意一种或多种：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述调控松墨天牛脂肪酸β氧化速率为通过降低松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因maddhd2的表达水平提高松墨天牛脂肪酸β氧化速率。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述调控松墨天牛携带松材线虫能力为通过降低松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因maddhd2的表达水平降低松墨天牛携带松材线虫能力。

5.权利要求1所述的松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因maddhd2的荧光定量引物对，其特征在于：所述荧光定量引物对的序列为：

6.权利要求1所述的松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因maddhd2的dsrna，其特征在于：所述dsrna是由seq id no.4所示的核苷酸序列和与seq id no.4所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链rna。

7.权利要求6所述的dsrna的制备方法，其特征在于：根据松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因maddhd2设计dsrna引物对并通过pcr扩增得到带有t7启动子序列的dna，以所述带有t7启动子序列的dna为模板经体外转录合成dsrna；所述带有t7启动子序列的dna的核苷酸序列如seq id no.3所示。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述dsrna引物对的序列为：

9.权利要求6所述的dsrna的应用，其特征在于：为如下任意一种或多种：

10.一种提高松墨天牛脂肪酸β氧化速率和/或降低松墨天牛携带松材线虫能力的方法，其特征在于：将权利要求6所述的dsrna注射入松墨天牛体内，注射部位为松墨天牛的前胸背板。

技术总结本发明涉及一种松墨天牛脂肪酸β氧化调控基因MaDDHD2及其dsRNA和应用。MaDDHD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。设计引物对用于合成干扰MaDDHD2基因的dsRNA，所述dsRNA由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列和与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成。将所述干扰MaDDHD2基因的dsRNA注射到松墨天牛前胸背板，结果表明：松墨天牛MaDDHD2基因表达明显降低，脂肪酸β氧化速率明显提高，携带松材线虫能力明显下降。表明MaDDHD2基因及其dsRNA具有调控松墨天牛脂肪酸β氧化速率及松墨天牛携带松材线虫能力的作用。本发明也可为松材线虫的防控提供理论基础。技术研发人员：曾丽琼,蔡守平,苏军,邹向莹,苏顺德受保护的技术使用者：福建省林业科学研究院技术研发日：技术公布日：2024/12/2