检测嗜冷黄杆菌的多重PCR引物对组合及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，特别是涉及检测嗜冷黄杆菌的多重pcr引物对组合及其应用。

背景技术：

1、嗜冷黄杆菌(flavobacteriumpsychrophilum)隶属于拟杆菌门(bacteroidetes)黄杆菌属(flavobacterium)，是一种低温致病菌，常在4～23℃下培养增殖，15～18℃为最适生长温度。嗜冷黄杆菌最初于20世纪40年代在美国从患病的银鲑鱼中分离出来，是细菌性冷水病的主要病原。现在嗜冷黄杆菌被认为是一种全球性的鲑鱼病原体，已经从大洋洲、欧洲、北美、南美和亚洲的患病鱼类中发现。自2019年春季开始，被称之为大宗淡水鱼“越冬综合征”(鱼瘟)的新发疫病在我国大宗淡水鱼养殖区密集性爆发，并呈现出愈演愈烈的态势，嗜冷黄杆菌被认为是其爆发的关键病原。

2、随着分子生物学技术的发展，pcr技术已广泛应用于病原的快速检测领域。多重pcr(multiplex pcr)技术是在常规pcr技术的基础上，通过将多对引物混合使用，优化反应条件后，实现一个细菌多对引物联合检测的目的，极大的提高了检测效率及检测结果的准确性，同时又保留了普通pcr敏感性及特异性高的特点。本发明拟开发嗜冷黄杆菌的多种特异性引物以及多重pcr检测方法，以提高嗜冷黄杆菌检测的特异性、灵敏性和准确性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供检测嗜冷黄杆菌的多重pcr引物对组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，使嗜冷黄杆菌检测的特异性、灵敏性和准确性有所提升。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供了检测嗜冷黄杆菌(flavobacteriumpsychrophilum)的特异性pcr引物对，所述特异性pcr引物对为fp88-f/r、fp995-f/r、fp1024-f/r、fp90-f/r、2fp90-f/r或2fp1022-f/r；

4、所述fp88-f/r包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物；

5、所述fp995-f/r包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物；

6、所述fp1024-f/r包括核苷酸序列如seq id no.5所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.6所示的下游引物；

7、所述fp90-f/r包括核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物和核苷酸序列如seq idno.8所示的下游引物；

8、所述2fp90-f/r包括核苷酸序列如seq id no.9所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.10所示的下游引物；

9、所述2fp1022-f/r包括核苷酸序列如seq id no.11所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.12所示的下游引物。

10、本发明还提供一种检测嗜冷黄杆菌的多重pcr引物对组合，所述多重pcr引物对组合为组合①、组合⑥或组合

11、所述组合①包括引物对fp88-f/r、fp995-f/r和fp1024-f/r；

12、所述组合⑥包括引物对fp90-f/r、fp995-f/r和fp1024-f/r；

13、所述组合包括引物对2fp90-f/r、fp1024-f/r和2fp1022-f/r；

14、所述fp88-f/r包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物；

15、所述fp995-f/r包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物；

16、所述fp1024-f/r包括核苷酸序列如seq id no.5所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.6所示的下游引物；

17、所述fp90-f/r包括核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.8所示的下游引物；

18、所述2fp90-f/r包括核苷酸序列如seq id no.9所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.10所示的下游引物；

19、所述2fp1022-f/r包括核苷酸序列如seq id no.11所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.12所示的下游引物。

20、本发明还提供上述的特异性pcr引物对在制备嗜冷黄杆菌的pcr检测试剂盒中的应用。

21、本发明还提供上述的多重pcr引物对组合在制备嗜冷黄杆菌的多重pcr检测试剂盒中的应用。

22、本发明还提供一种嗜冷黄杆菌的pcr检测试剂盒，包括上述的特异性pcr引物对。

23、本发明还提供一种嗜冷黄杆菌的多重pcr检测试剂盒，包括上述的多重pcr引物对组合。

24、本发明还提供一种非疾病诊断目的检测嗜冷黄杆菌的pcr方法，包括以下步骤：

25、提取得到待检样品的基因组dna；

26、以所述基因组dna为模板，采用上述的特异性pcr引物对进行pcr扩增，得到扩增产物，并进行电泳检测；

27、根据电泳检测结果判定所述待检样品中是否含有嗜冷黄杆菌：

28、当采用所述fp88-f/r进行pcr扩增时，如果检测得到172bp的电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌；

29、当采用所述fp995-f/r进行pcr扩增时，如果检测得到325bp的电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌；

30、当采用所述fp1024-f/r进行pcr扩增时，如果检测得到610bp的电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌；

31、当采用所述fp90-f/r进行pcr扩增时，如果检测得到197bp的电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌；

32、当采用所述2fp90-f/r进行pcr扩增时，如果检测得到470bp的电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌；

33、当采用所述2fp1022-f/r进行pcr扩增时，如果检测得到914bp的电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌。

34、进一步地，所述pcr扩增的反应体系为：上、下游引物各1μl、2×taq plus pcrmaster mix 10μl、dna模板2μl和ddh2o 6μl；

35、所述pcr扩增的扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环扩增35次；72℃延伸10min。

36、本发明还提供一种非疾病诊断目的检测嗜冷黄杆菌的多重pcr方法，包括以下步骤：

37、提取得到待检样品的基因组dna；

38、以所述基因组dna为模板，采用上述的多重pcr引物对组合进行多重pcr扩增，得到扩增产物，并进行电泳检测；

39、根据电泳检测结果判定所述待检样品中是否含有嗜冷黄杆菌：

40、当采用所述组合①进行多重pcr扩增时，如果出现172bp、325bp和610bp三种电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌；

41、当采用所述组合⑥进行多重pcr扩增时，如果出现197bp、325bp和610bp三种电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌；

42、当采用所述组合进行多重pcr扩增时，如果出现470bp、610bp和914bp三种电泳条带，则判定所述待检样品中含有嗜冷黄杆菌。

43、进一步地，当采用所述组合①进行多重pcr扩增时，所述多重pcr扩增的反应体系为：2×taq plus pcr master mix 10μl，体积比fp88-f/r：fp995-f/r：fp1024-f/r＝1：1：3的引物对组合3μl，dna模板2μl，加ddh2o补足至20μl；所述多重pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环扩增35次；72℃延伸10min；

44、当采用所述组合⑥进行多重pcr扩增时，所述多重pcr扩增的反应体系为：2×taqplus pcr master mix 10μl，体积比fp90-f/r：fp995-f/r：fp1024-f/r＝2：1：2的引物对组合3μl，dna模板2μl，加ddh2o补足至20μl；所述多重pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环扩增35次；72℃延伸10min；

45、当采用所述组合进行多重pcr扩增时，所述多重pcr扩增的反应体系为：2×taqplus pcr master mix 10μl，体积比2fp90-f/r：fp1024-f/r：2fp1022-f/r＝3：1：3的引物对组合3μl，dna模板2μl，加ddh2o补足至20μl；所述多重pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环扩增35次；72℃延伸10min。

46、本发明公开了以下技术效果：

47、本发明首先通过高通量测序技术获得嗜冷黄杆菌全基因组序列，将全基因组序列在ncbi数据库中逐一对比，找到与其他基因组完全不匹配的特异性序列，根据特异性序列设计特异性引物，并通过其他菌株检测引物的特异性，最终筛选到特异性高的引物。之后设计了嗜冷黄杆菌多重pcr引物对组合并利用其进行多重pcr检测，结果显示，本发明设计并筛选得到的多重pcr引物对组合对于检测目标嗜冷黄杆菌具备良好的扩增效果，采用其进行嗜冷黄杆菌检测具有显著特异性和较高的检测灵敏度。引物对组合fp88-f/r、fp995-f/r和fp1024-f/r对低至3pg/μl混合样品仍可检出；引物对组合fp90-f/r、fp995-f/r和fp1024-f/r对低至6pg/μl混合样品仍可检出；引物对组合2fp90-f/r、fp1024-f/r和2fp1022-f/r对低至12pg/μl混合样品仍可检出。

48、用于鱼体检测，本发明的试剂盒具有较好的应用价值，为嗜冷黄杆菌的快速检测提供了新的技术支持，可以助力于鱼类细菌性冷水病的防控。