白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法与流程

本申请涉及白色茶薪菇保藏，特别是一种白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法。

背景技术：

1、白色茶薪菇(cyclocybe chaxingu)隶属于担子菌门、蘑菇纲、蘑菇目、假脐菇科、环伞属；别名油茶菇、茶菇等，商品名为茶树菇。白色茶薪菇营养丰富、风味独特、口感极佳，具有清热、平肝、利尿和健脾等功效，素有“中华神菇”美誉。

2、白色茶薪菇具有高蛋白、低脂肪、低糖分等营养特性和抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、凝集红细胞等药理作用，广受消费者喜爱，具有广阔市场前景。白色茶薪菇是我国大宗栽培重要食用菌之一。据统计，2021年我国白色茶薪菇鲜菇产量为89.47万吨，在食用菌中位居第8，年产值约90亿元，具有重要的经济价值。

3、现有研究主要集中于白色茶薪菇功能及栽培方法，对白色茶薪菇的菌种保藏研究较少。目前茶薪菇菌种常见保藏方法为斜面移植法，该保藏方法成本低廉、操作简单，适用于不超过一年的菌种短期保藏，但存在耗时多、占用空间大、遗传和生物学特性易发生改变等缺点，不适合于菌种的长期保藏。

4、茶薪菇菌种低温保藏的方法，目前的报道是取茶树菇液体菌种0.5ml,加入1ml的60％浓度的甘油和0.5ml的1％浓度的黄原胶作为保护液，或加入1ml的60％浓度的甘油和0.5ml的20％浓度的甘露醇作为保护液，-20℃液体管冷冻保藏；该方法只适合茶薪菇菌种的中期保藏，更长周期的保藏效果不如液氮保藏。面对茶薪菇如此大规模的栽培面积，为了防止菌种退化，开展菌种的液氮长期保藏工作显得尤为重要。关于茶薪菇的液氮长期保藏方法研究目前未见报道。

5、现有菌种保藏方法虽然种类繁多，但其实现效果优劣评价标准为：保藏后是否能保持原有菌种活性和生物学特性，同时，保证长期保藏过程中防止菌种发生变异、退化、污染等情况。保证保藏、解冻后菌种尽可能接近原始菌株状态。

6、目前菌种保藏如：低温保存、蒸馏水保藏法、矿物油保存、硅胶保藏法、冷冻干燥保藏法等，其原理均是通过低温、真空、干燥等方法，将菌株的生理代谢活性降至最低，以此抑制菌株的生长代谢作用，使其生命活动处于休眠状态，以降低物质消耗，保持菌种活性。

7、液氮保藏法通过将菌株逐级降温后在超低温环境下保藏方法，是长期保存食用菌菌种主要选择，双孢蘑菇、草菇、香菇、羊肚菌等大多数食用菌菌种都可以在液氮保藏条件下保持活力，但低温保藏最大的难点在于，低温环境下细胞会脱水或胞内细胞液形成冰晶，对真菌细胞膜和细胞壁造成损伤。甘油和dmso是常用的生物低温保护剂，保护剂通过与水发生水合反应，增加溶液黏性，从而在一定程度上抑制冰晶的产生，最终达到保护细胞的效果。

8、未见专门用于白色茶薪菇的液氮超低温保藏、解冻方法。

9、公开于背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域普通技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本申请针对上述技术问题提供了一种白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，该方法能有效保持液氮环境下保藏后解冻复苏菌种的活性，复苏后菌株的活性、生物学特性与保藏前初始状态近似。

2、本申请提供了一种白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，包括以下步骤：

3、保藏操作：将白色茶薪菇菌株生物材料没入保护剂中并充分混匀后，使用程序降温盒以1℃/min降温至-80℃后，最后放入液氮进行保藏；

4、解冻操作：将保藏后的白色茶薪菇菌株生物材料取出后，在恒温30～40℃下水浴解冻至白色茶薪菇菌株及保护剂完全融化，将菌种材料接种于pda培养基后在25-28℃下培养；

5、保护剂为：灭菌后的pda液体培养基与二甲基亚砜按体积比为1：9混合得到；

6、白色茶薪菇为菌株zjcxg001，保藏证号为cgmcc no.23860。

7、优选地，在保藏操作前：将白色茶薪菇菌株接种于pda平板培养基上，在24～26℃下培养8～10d至平板上长满菌丝，采用灭菌镊子刮取菌丝获取白色茶薪菇菌株进行保藏。

8、优选地，解冻操作后所得白色茶薪菇菌株生物材料接种于pda培养基后，在25-28℃下培养24h后，菌种开始萌发，8天后菌丝长满平板。

9、优选地，解冻操作后白色茶薪菇菌株的生长速度大于等于0.63

10、cm/d。

11、优选地，液氮中保存时间大于等于12个月。

12、优选地，白色茶薪菇菌株生物材料包括：木屑种、平板菌丝块、平板菌丝种、液体种。

13、优选地，木屑种的制备方法为：将白色茶薪菇菌株接种于灭菌的木屑试管中，在25-28℃恒温生化培养箱，培养15～20天后长满菌丝，得到木屑种。

14、优选地，平板菌丝块的制备方法：在pda平板培养基上接种白色茶薪菇菌株后，在25-28℃下培养至平板上长满菌丝，沿平板边缘打孔获取平板菌丝块。

15、优选地，平板菌丝种的制备方法：在pda平板培养基上接种白色茶薪菇菌株后，在25-28℃下培养至平板长满菌丝，用镊子收集平板菌丝得到菌丝种。

16、优选地，液体种的制备方法：白色茶薪菇菌株接种于pda液体培养基中，在500rpm/min、温度20～25-28℃下培养至长满菌丝得到液体种。

17、优选地，pda液体培养基为马铃薯150～250g/l、葡萄糖15～25g/l，加水定容至1l，自然ph。

18、优选地，pda平板培养基为马铃薯150～250g/l，葡萄糖15～25g/l，琼脂18-20g/l，加水定容至1l，自然ph。

19、本申请能产生的有益效果包括：

20、1)本申请所提供的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，通过该方法保藏的菌种重新复活后，菌种活性及其生物学特性仍然近似于保藏前的初始状态，在25-28℃下培养24h后菌种开始萌发，8天后菌丝长满平板，说明该方法能较好的保持菌株的活性，保藏、解冻复苏后菌株8天在pda上的生长速度为0.63cm/d。

21、2)本申请所提供的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，该方法首次系统的研究了白色茶薪菇菌株的液氮超低温保藏技术，并且在保藏中使用二甲基亚砜作为保护剂，筛选出了该菌株最适保护剂及其浓度，菌株复苏后能够有效保持菌株活性，菌种活性及其生物学特性仍然保持着保藏前的初始状态，说明该方法适合于长期保存菌株。复苏后菌株的f1代、f2代生长情况无明显差别。

22、3)本申请所提供的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，该方法对比了平板菌丝、平板菌丝块、液体种和木屑种四种保藏材料进行液氮超低温保藏复苏后菌种的萌发速度和生长速度。常规的食用菌菌种保藏材料通常是液体菌种或者打孔的菌丝块，本申请中首次采用无菌镊子刮取pda平板上长满的白色茶薪菇菌丝作为保藏材料，该采集手段所得菌丝，在保藏时能更好的与保护剂充分接触混匀，使菌种得到较好的保护效果。

技术特征：

1.一种白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，解冻操作后所得白色茶薪菇菌种材料接种于pda培养基后，在25-28℃下培养24h后，菌种开始萌发，8天后菌丝长满平板，生长速度大于等于0.63cm/d。

3.根据权利要求1所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，液氮中保存时间大于等于12个月。

4.根据权利要求1所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，白色茶薪菇菌株生物材料包括：木屑种、平板菌丝块、平板菌丝种、液体种。

5.根据权利要求4所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，木屑种的制备方法为：将白色茶薪菇菌株接种于灭菌的木屑试管中，在25-28℃恒温生化培养箱，培养15～20天后长满菌丝，得到木屑种。

6.根据权利要求4所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，平板菌丝块的制备方法：在pda平板培养基上接种白色茶薪菇菌株后，在25-28℃下培养至平板上长满菌丝，沿平板边缘打孔获取平板菌丝块。

7.根据权利要求4所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，平板菌丝种的制备方法：在pda平板培养基上接种白色茶薪菇菌株后，在25-28℃下培养至平板长满菌丝，得到菌丝种。

8.根据权利要求4所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，液体种的制备方法：白色茶薪菇菌株接种于pda液体培养基中，在500rpm/min、温度20～25-28℃下培养至长满菌丝得到液体种。

9.根据权利要求1所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，pda液体培养基为马铃薯150～250g/l、葡萄糖15～25g/l，加水定容至1l，自然ph。

10.根据权利要求6或7所述的白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，其特征在于，pda平板培养基为马铃薯150～250g/l，葡萄糖15～25g/l，琼脂18-20g/l，加水定容至1l，自然ph。

技术总结本申请公开了一种白色茶薪菇菌株超低温保藏及其解冻方法，包括以下步骤：保藏操作：将白色茶薪菇菌株生物材料没入保护剂中并充分混匀后，使用程序降温盒以1℃/min降温至‑80℃后，最后放入液氮进行保藏；解冻操作：将保藏后的白色茶薪菇菌株生物材料取出后，在恒温30～40℃下水浴解冻至白色茶薪菇菌种材料及保护剂完全融化，将菌种材料接种于PDA培养基后在25‑28℃下培养；保护剂：为灭菌后的PDA液体培养基与二甲基亚砜按体积比为1：9混合得到；菌株生物材料为白色茶薪菇菌株ZJCXG001，保藏证号为CGMCC No.23860。通过该方法保藏的菌种重新复活后，菌种活性及其生物学特性仍然近似于保藏前的初始状态，在25‑28℃下培养24h后菌种开始萌发，8天后菌丝长满平板，说明该方法能较好的保持菌株的活性。技术研发人员：华蓉,孙达锋,张晓华,刘绍雄,李雪松,岳婷松,罗孝坤,岳万松,高章会,李建英受保护的技术使用者：中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所技术研发日：技术公布日：2024/12/2