一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法及应用与流程

本发明涉及分析检测，特别是涉及一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法及应用。

背景技术：

1、呕吐毒素，又名脱氧雪腐镰刀醇（don），属于常见的真菌毒素。近年来，猪肝中被多次发现有呕吐毒素存在，对人们的食品健康安全造成巨大威胁，但猪肝内呕吐毒素的提取及检测至今还是空白，同时受猪肝基质效应的影响，常规检测手段难以对呕吐毒素进行定量检测。don的检测方法有：高效液相色谱-串联质谱法（lc-ms/ms）、高效液相色谱法（hplc）、酶联免疫（elisa）检测方法、薄层色谱法（tlc）以及胶体金免疫层析技术等。其中，以tlc和胶体金免疫层析技术为原理的快速检测试纸属于定性检测，其余方法属于定量检测。然而，目前gc分析与hplc需要复杂的前处理分析，上机时间长，无法短时间内出结果。因此，需要开发一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法及应用。

2、根据本发明的一个方面，提供了一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，包括以下步骤：

3、s1.将待测猪肝样品用粉碎机粉碎后混匀，称取试样，加入甲酸水溶液，涡旋震荡，超声后离心处理，获得上清液和沉淀；

4、s2.将上清液全部转移至ips-rt-y53自动过柱仪上样，收集洗脱液于离心管中；

5、s3.将收集到的洗脱液涡旋混匀，微孔滤膜过滤，得到待测液；

6、s4.将待测液进行高效液相色谱-质谱检测，获得呕吐毒素的峰面积，并根据呕吐毒素的标准曲线，计算得到待测猪肝中呕吐毒素的含量。

7、在一些实施方式中，步骤s1中甲酸水溶液是浓度为0.3%的甲酸水溶液。

8、在一些实施方式中，步骤s1中超声处理的温度条件为4℃，步骤s1中离心的转速为8000～10000r/min。

9、在一些实施方式中，步骤s3中微孔滤膜的孔径为0.22μm。

10、在一些实施方式中，步骤s3中ips-rt-y53自动过柱仪采用don-ips专用柱，don-ips专用柱的型号为普瑞邦iac-030-3，规格为25t，柱容量为3ml，过柱压力为0.2mpa，流速为2ml/min，活化液为甲醇+水（体积比为1:1），淋洗液为水，洗脱剂为甲醇+25%氢氧化铵溶液+水（体积比为7:0.5:2.5）。

11、在一些实施方式中，步骤s4中液相的色谱条件为：色谱柱：acquity uplc behc18-hilic-diol串联色谱柱体系，acquity uplc beh c18色谱柱的规格：2.1 m×100 mm，1.7μm；hilic-diol色谱柱的规格为：4.6m×250 mm，5μm；进样量：5μl；柱温：30℃；流速：0.20ml/min；采用流动相a和b进行梯度洗脱，流动相a为0.1%甲酸甲醇溶液，流动相b为0.1%甲酸纯水；梯度洗脱程序如下：

12、0~0.5min，流动相a：95%，流动相b：5%；

13、0.5~1.5min，流动相a：由95%降至35%，流动相b：由5%升至65%；

14、1.5~4.5min，流动相a：35%，流动相b：65%；

15、4.5~4.6min，流动相a：由35%升至95%，流动相b：由65%降至5%；

16、4.6~6.0min，流动相a：95%，流动相b：5%。

17、在一些实施方式中，步骤s4中质谱条件为：离子源：电喷雾电离源（esi）；扫描模式：多反应监控（mrm）；正负离子模式：正离子模式；模式温度：550℃；时间：6min；毛细管电压：1.00 kv；离子源温度（tem）：550℃；去溶剂气体流量：氮气，1000 l/h；碰撞气：氩气；质谱检测中所用的其余雾化气、气帘气、辅助气均为高纯氮气。

18、在一些实施方式中，步骤s4中质谱检测时，呕吐毒素的质谱参数如下：

19、呕吐毒素的碎片离子对（m/z）为297.1/202.9，定量离子对（m/z）为297.1/202.9，锥孔电压为20v，碰撞能量为16v；

20、呕吐毒素的碎片离子对（m/z）为297.1/249.1，定量离子对（m/z）为297.1/202.9，锥孔电压为20v，碰撞能量为10v。

21、根据本发明的另一个方面，提供了一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法在检测猪肝中呕吐毒素含量方面的应用。

22、本发明的有益效果：本发明建立了一种高效液相色谱-质谱联用测定猪肝中呕吐毒素含量的方法，既去除了样品中大部分的基质干扰，又提高了整体实验前处理的效率，呕吐毒素在1.00-80.0ng/ml浓度范围时测定得到标准曲线，其中线性相关系数r2=0.999479，检出限为0.147μg/kg；呕吐毒素在加标浓度为1.00-80.0ng/ml浓度范围内，加标回收率在82.8%～99.2%，精密度为2.8%～5.3%。本发明弥补了猪肝基质中检测呕吐毒素的空白，其检出限低，精密度高，经济实用、样品提取稳定性好，适用于猪肝中呕吐毒素的快速准确定性定量检测。

技术特征：

1.一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，其特征在于，所述步骤s1中甲酸水溶液是浓度为0.3%的甲酸水溶液。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，其特征在于，所述步骤s1中超声处理的温度条件为4℃，所述步骤s1中离心的转速为8000～10000r/min。

4.根据权利要求1所述的一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，其特征在于，所述步骤s3中微孔滤膜的孔径为0.22μm。

5.根据权利要求1所述的一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，其特征在于，所述步骤s3中ips-rt-y53自动过柱仪采用don-ips专用柱，所述don-ips专用柱的型号为普瑞邦iac-030-3，规格为25t，柱容量为3ml，过柱压力为0.2mpa，流速为2ml/min，活化液为甲醇+水（体积比为1:1），淋洗液为水，洗脱剂为甲醇+25%氢氧化铵溶液+水（体积比为7:0.5:2.5）。

6.根据权利要求1所述的一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，其特征在于，所述步骤s4中液相的色谱条件为：色谱柱：acquity uplc beh c18-hilic-diol串联色谱柱体系，acquity uplc beh c18色谱柱的规格：2.1 m×100 mm，1.7μm；hilic-diol色谱柱的规格为：4.6m×250 mm，5μm；进样量：5μl；柱温：30℃；流速：0.20ml/min；采用流动相a和b进行梯度洗脱，流动相a为0.1%甲酸甲醇溶液，流动相b为0.1%甲酸纯水；梯度洗脱程序如下：

7.根据权利要求1所述的一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，其特征在于，所述步骤s4中质谱条件为：离子源：电喷雾电离源（esi）；扫描模式：多反应监控（mrm）；正负离子模式：正离子模式；模式温度：550℃；时间：6min；毛细管电压：1.00 kv；离子源温度（tem）：550℃；去溶剂气体流量：氮气，1000 l/h；碰撞气：氩气；质谱检测中所用的其余雾化气、气帘气、辅助气均为高纯氮气。

8.根据权利要求1所述的一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法，其特征在于，所述步骤s4中质谱检测时，呕吐毒素的质谱参数如下：

9.权利要求1~8中任一项所述的一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法在检测猪肝中呕吐毒素含量方面的应用。

技术总结本发明公开了一种快速检测猪肝中呕吐毒素含量的方法及应用，包括以下步骤：S1.将待测猪肝样品粉碎混匀，加入甲酸水溶液，涡旋震荡，超声，离心，获得上清液；S2.IPS‑RT‑Y53自动过柱仪上样，收集洗脱液；S3.制备待测液；S4.进行高效液相色谱‑质谱检测，获得呕吐毒素的峰面积，并根据呕吐毒素的标准曲线，计算得到待测猪肝中呕吐毒素的含量。本发明的方法，既去除了样品中大部分的基质干扰，又提高了前处理效率，能够准确检测猪肝中呕吐毒素含量，检出限为0.147μg/kg；加标回收率在82.8%～99.2%，精密度为2.8%～5.3%，检出限低，精密度高，适用于猪肝中呕吐毒素的快速准确定性定量检测。技术研发人员：陈彤,邱永为,韩银涛,李湘媛,全志学,林基浩受保护的技术使用者：深圳市农产品质量安全检验检测中心（深圳市动植物疫病预防控制中心）技术研发日：技术公布日：2024/12/2