一种磁微粒化学发光法蛋白检测方法与流程

本发明属于医学免疫的，特别是涉及一种磁微粒化学发光法蛋白检测方法。

背景技术：

1、化学发光技术是目前免疫诊断技术不断更新迭代后的主流方向，试剂产品具有灵敏性高、线性动力学范围宽、定量检测精确、结果稳定误差小、操作简便等优势，在临床应用中脱颖而出，成为了免疫定量分析领域的主流产品。化学发光免疫测定是公认先进的标记免疫测定技术，原理一般为将捕获抗原或抗体包被在超顺磁微粒表面，在将标记抗原或抗体吸附或共价偶联在发光化物上，此类发光物常见为碱性磷酸酶、鲁米诺、光泽精、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、三联吡啶钌等。

2、现有工艺技术中，通常使用化学交联剂进行蛋白修饰，如在羧基化磁珠包被蛋白工艺中，使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（edc）对羧基基团进行活化，活化后具有酰胺残基与抗原或抗体的ε-氨基酸形成稳定的共价键。碱性磷酸酶标记抗原或抗体中，通常对2种蛋白进行化学修饰，使用(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（smcc）修饰为酰胺键中间体，同时使用2-亚氨基硫烷盐酸盐（traut’s）处理抗原或抗体，修饰为具有巯基基团（-sh）的中间体，纯化后将两者形成具有双特异性活化基团进行蛋白偶联，使用交联剂对抗体或抗原进行活化的过程，本质上是对蛋白结构的修饰或破坏，该结构的改变在一定程度上导致蛋白的天然亲和力或免疫活性的降低。

3、在免疫类体外诊断试剂开发过程中，抗原抗体的免疫反应往往会受到化学修饰的影响而降低反应效率，导致灵敏度下降或特异性不满足要求，特别是针对大分子蛋白间的偶联，在形成免疫复合物过程中，空间位阻效应比较明显，对于血液中低丰度的标志物往往难以被捕获，大大降低了抗原或抗体自身的亲和力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种磁微粒化学发光法蛋白检测方法，主要解决抗原抗体的免疫反应受到化学修饰的影响而降低反应效率的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种磁微粒化学发光法蛋白检测方法，包括以下几个步骤，

4、（1）r1组分形成：将表面改性的磁微粒与鸡抗鼠igy抗体按质量比100:1混合，并加入第一稀释液，制备得到10mg/ml的磁微粒试剂半成品；

5、（2）r2组分形成：将未被化学修饰的鼠抗人捕获抗体与样本中的目标蛋白充分反应，然后按质量比0.04:1加入到r1组分，进行非特异结合，37℃下缓慢混匀30min，加入第二稀释液使终体系中包被抗体的浓度为0.1~0.5μg/ml，制备得到r2组分；

6、（3）r3组分的形成：取5μl的生物素化碱性磷酸酶加入到0.1mg的链霉亲和素化protein a中，进行非特异结合，37℃下避光缓慢混匀，反应1h，过超滤管进行纯化，取纯化液，用第三稀释液稀释至终浓度0.4mg/ml，得到r3组分；

7、（4）r4组分的形成：r2组分中加入未被化学修饰的鼠抗人检测抗体，充分反应，磁分离清洗后按质量比0.5:1加入到r3组分中，37℃下缓慢混匀30min，制成r4组分，按质量比例1：10000加入至第四稀释液，终体系中，检测抗体的浓度为0.5μg/ml；

8、（5）r4组分中加入底物液进行光激发，发光值与目标蛋白呈线性关系进而定量检测样本中的目标蛋白含量。

9、进一步地，r1组分对应的表面改性的磁微粒为羧基磁微粒，其表面修饰基团为-cooh、-nh2、或-sh基团，粒径在270nm~300nm。

10、磁微粒可根据表面化学基团不同而用于不同的检测领域，外围高分子材料可以通过物理或化学的方法活化产生氨基(nh2-)、羧基(cooh-)或环氧基(—ch(o))等基团，可以与蛋白等生物活性分子偶联，其中用途最广泛的为羧基化磁微粒，羧基磁微粒即为表面修饰有羧基官能团且具有超顺磁性的磁性微粒,是功能性生物磁珠的一种,在磁场中能够迅速聚集,离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散。

11、羧基磁微粒的表面修饰往往采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（edc）化学交联剂活化磁微粒表面的羧基（cooh-），形成胺反应性o-酰基异脲中间体，该中间体可与氨基快速反应形成酰胺键，从而使目标蛋白的伯氨基与活化后的o-酰基异脲中间体共价偶联，这种偶联方式稳定不脱落且效率高，是目前采用最多的偶联方法。

12、羧基磁性微球呈单分散不团聚的规整圆球形,具有超顺磁性、快速磁响应性、丰富羧基官能团、单分散性和亚微米尺度粒径等特点,能够在特殊化学试剂(如edc)的作用下将多肽、蛋白、抗体、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到微球表面,是医学与分子生物学研究中重要的载体工具。

13、进一步地，r1组分对应的第一稀释液包括na2hpo4 2h2o 7.21g/l、nah2po4 12h2o1.31g/l、nacl 9.00g/l、proclin 950 1.00g/l、蔗糖 50.00g/l、albumin bovine v5.00g/l、tween-80 0.50g/l。

14、进一步地，r2组分对应的第二稀释液包括2％albumin bovine v、1% proclin950、0.5% tween-80。

15、进一步地，r3组分中第三稀释液为1×pbs稀释液，包括0.1mol/l tris base、0.9%nacl、0.5％albumin bovine v、1% proclin950。

16、进一步地，r4组分中第四稀释液包括0.5% albumin bovine v、1%蔗糖、5%甘油、0.1% proclin950、0.05% tween-80。

17、检测原理为双抗体夹心法，将磁珠包被的鸡抗鼠igy抗体与目标鼠抗人igg抗体结合，制成r1复合物；将链霉亲和素化的protein a与生物素化的碱性磷酸酶结合，形成生物素-亲和素复合物，将该复合物与目标鼠抗人igg抗体结合，制成r2复合物；将待检临床样本与r1复合物和r2复合物进行孵育，此过程中样本中的待测物与r1和r2形成三明治夹心结构复合物。经过清洗后，除去样本中未结合的其它成分。随后加入预激发液和激发液，碱性磷酸酶在激发液的作用下会发出特定波长的光，发光强度与样本中待测物的浓度成正比，经校准曲线的处理可以得到样本中待测物的含量，由此对待检临床样本中的待测物进行定量检测。

18、本发明具有以下有益效果：本发明的方法学提供的方法为一种模型化体系，适用于任何免疫诊断试剂项目，避免包被抗体和检测抗体在偶联过程中被破坏免疫活性，将包被抗体和检测抗体直接参与免疫反应，又引入生物素-亲和素体系，大大提高检测灵敏度，适用于如阿尔茨海默病或细胞因子风暴等低丰度疾病标志物的检测。

19、鸡抗鼠igy抗体与磁微粒偶联物标记工艺稳定，链霉亲和素化的protein a与生物素化的碱性磷酸酶偶联物标记工艺稳定，在本发明方法学体系简化了标记工艺优化和体系优化的过程，最大程度保证了工艺稳定性和生产稳定性，节省项目开发的时间成本、人力成本和财力成本。