一种靶向鱼类无乳链球菌SIP蛋白的纳米抗体Nb12制备及其应用的制作方法

本发明涉及渔业病害防控，尤其涉及一种靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12及其应用。

背景技术：

1、罗非鱼(oreochromis sp.)是联合国粮农组织(fao)向全球推荐的最重要的水产养殖品种之一。2023年我国罗非鱼养殖产量高达181.68万吨，是全球最大的罗非鱼生产国。近年来，随着养殖规模的扩大和养殖密度的增加，我国罗非鱼主要养殖地区暴发以无乳链球菌(streptococcus agalactiae，gbs)为主的链球菌病，其危害之大，被称为罗非鱼养殖业的“h1n1”，给罗非鱼养殖业带来巨大的经济损失。目前，抗生素仍是养殖环境中防控无乳链球菌病的主要方法。然而抗生素的长期使用和滥用，不但导致无乳链球菌产生严重的耐药性，还引起了环境污染、食品安全等一系列问题。

2、在罗非鱼无乳链球菌病的发展过程中，无乳链球菌毒力因子在入侵以及裂解宿主细胞等方面发挥重要作用。毒力因子有许多种，可以分为两大类：结构产物和分泌产物。结构产物一般与菌体的黏附与定植有关，而分泌产物常常与入侵和损伤机体细胞、组织有关。其中，表面免疫原性蛋白(surface immunogenic protein，sip)是gbs的结构产物，位于细菌的表面，并参与菌体对宿主细胞和组织的黏附、定植过程。各类血清型gbs都能表达sip蛋白，且sip基因在gbs中高度保守，具有潜在的免疫原性，是无乳链球菌疫苗抗原的重要候选蛋白。

3、20世纪90年代，hamers等发现骆驼科动物血清中存在着一种天然缺失了轻链部分，只含有重链部分的重链抗体(heavy-chain antibodies，hcabs)。将骆驼科动物体内hcabs的可变区基因进行克隆，可以得到一种仅由重链可变区构成的重链可变区单域抗体(variable domain of heavy-chain antibodies，vhh)，又称纳米抗体(nanobodies，nbs)。vhh的单结构域具有分子量小、组织穿透能力强、耐受力强、亲和力高、水溶性好、易克隆重组、产量高和成本低等优良的特性，推动了其在疾病诊断和治疗等领域的应用。

4、为此，亟需利用vhh的优异特性开发出一种针对无乳链球菌的新型绿色防控方法。

技术实现思路

1、针对以上不足，本发明提供一种靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12，能够用于制备抑制无乳链球菌感染鱼类的中和抗体，解决当前鱼类缺乏有效防控无乳链球菌病中和抗体的问题。具体技术方案如下：

2、一种靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12，所述纳米抗体nb12包含重链可变区vhh，所述vhh包括4个抗体可变区内骨架区fr1、fr2、fr3、fr4和3个互补决定簇cdr1、cdr2、cdr3，如下：

3、fr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，即avqlvesgggmvqaggslklscvas；

4、fr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，即mgwfrqaqgkereiiag；

5、fr3的氨基酸序列如seq id no.3所示，即yyqdsvkdrftifrdnakntvflqmnslrpedtgvyyc；

6、fr4的氨基酸序列如seq id no.4所示，即wgqgtqvtvss；

7、cdr1的氨基酸序列如seq id no.5所示，即grtfstlg；

8、cdr2的氨基酸序列如seq id no.6所示，即iswtgqat；

9、cdr3的氨基酸序列如seq id no.7所示，即aasrsdydplfgs；

10、所述骨架区fr1-4和互补决定簇cdr1-3按顺序交错排列，重链可变区vhh的氨基酸序列如seq id no:8所示，即：

11、avqlvesgggmvqaggslklscvasmgwfrqaqgkereiiagyyqdsvkdrftifr dnakntvflqmnslrpedtgvyycwgqgtqvtvssgrtfstlgiswtgqataasrsdyd plfgs。

12、本发明还提供以上所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12的制备方法，包括如下步骤：

13、s1、利用基因工程技术将编码vhh基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因中，随着噬菌体的繁殖，vhh会以融合蛋白的方式表达在子代噬菌体的衣壳蛋白上；

14、s2、然后利用包被于固定介质中的抗原与vhh之间的亲和作用，将特异性结合抗原的vhh选择性亲和淘选；

15、s3、经过2-4轮亲和淘选后所得的噬菌体阳性单克隆子进行elisa测定，对阳性克隆菌株进行扩培送并测序分析，即可得到sip蛋白的纳米抗体nb12。

16、进一步，所述亲和淘选的具体步骤为：

17、在免疫管上将包被纯化复性后sip蛋白用脱脂奶粉进行封闭，并加入vhh噬菌展示体库，充分孵育，然后用洗涤液洗涤15-25次除去未特异性结合sip蛋白的噬菌体；用洗脱液洗脱剩余的结合噬菌体颗粒，随后加入10％ aebsf终止洗脱；最后，将洗脱的噬菌体感染复合菌株，感染后35-40℃下过夜扩陪，使用peg/2.5m nacl溶液沉淀纯化扩增的噬菌体，收集沉淀并用pbs溶液重悬，即为特异性结合的噬菌体颗粒，用于下一轮的筛选过程。

18、进一步，所述洗涤液为含0.05％ tween 20的pbs溶液t溶液。

19、进一步，所述洗脱液为0.25mg/ml的trypsin溶液。

20、进一步，所述复合菌株为大肠杆菌ss320菌株和m13k07辅助噬菌体。

21、本发明还提供了一种上述靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12的应用，本发明的纳米抗体nb12与无乳链球菌sip蛋白蛋白可特异性结合，应用于制备抑制无乳链球菌感染鱼类的中和抗体，以及应用于相关渔业病害防控。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

23、本发明制备的纳米抗体nb12，能够高亲和靶向罗非鱼无乳链球菌sip蛋白，为开发新一代绿色抗菌药剂的开发提供基础，具有重要的应用价值。

技术特征：

1.一种靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12，其特征在于，所述纳米抗体nb12包含重链可变区vhh，所述vhh包括4个抗体可变区内骨架区fr1、fr2、fr3、fr4和3个互补决定簇cdr1、cdr2、cdr3；

2.根据权利要求1所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12，其特征在于，所述骨架区fr1-4和互补决定簇cdr1-3按顺序交错排列，重链可变区vhh的氨基酸序列如seq id no:8所示。

3.根据权利要求1～2任一项所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12的制备方法，其特征在于，所述s2步骤中，进行2-4轮亲和淘选。

5.根据权利要求3所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12的制备方法，其特征在于，亲和淘选的具体步骤为：

6.根据权利要求5所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12的制备方法，其特征在于，所述洗涤液为含0.05％tween 20的pbs溶液t溶液。

7.根据权利要求5所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12的制备方法，其特征在于，所述洗脱液为0.25mg/ml的trypsin溶液。

8.根据权利要求5所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12的制备方法，其特征在于，所述复合菌株为大肠杆菌ss320菌株和m13k07辅助噬菌体。

9.权利要求1～2所述的任一项所述的靶向鱼类无乳链球菌sip蛋白的纳米抗体nb12在渔业病害防控中的应用。

技术总结本发明公开了一种靶向鱼类无乳链球菌SIP蛋白的纳米抗体Nb12制备及其应用，涉及渔业病害防控技术领域，本发明的用噬菌体展示技术筛选的以罗非鱼源无乳链球菌SIP蛋白为靶标的纳米抗体具有重链可变区VHH，所述VHH包括4个抗体可变区内骨架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定簇CDR1、CDR2、CDR3。本发明提供的纳米抗体Nb12与无乳链球菌SIP蛋白具有较高的亲和力，通过该抗体可靶向作用于SIP蛋白，且有效抑制了GBS在罗非鱼体内的增殖，具有优异的抗菌活性，应用于罗非鱼的病害防治。技术研发人员：王文欢,黄爱国,郭靖,张雄贤,王志燊受保护的技术使用者：广西产研院绿色低碳技术研究所有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/12