通过质谱法表征靶蛋白的制作方法

本技术涉及蛋白鉴定领域，更具体而言涉及通过质谱法表征靶蛋白的方法。

背景技术：

1、通过蛋白质消化产物的肽质量指纹图谱(pmf)进行蛋白质的常规鉴定已有25年历史。1993年，五组科学工作团队各自发表了该方法的基本要素：(1)henzel,w.j.,billeci,t.m.,stults,j.t.,wong,s.c.,grimley,c.和watanabe,c.(1993).proc natl acad sciusa 90,5011-5；(2)james,p.,quadroni,m.,carafoli,e.和gonnet,g.(1993).biochembiophys res commun 195,58-64；(3)mann,m.,hojrup,p.和roepstorff,p.(1993).biolmass spectrom 22,338-45；(4)pappin,d.j.c.,hojrup,p.和bleasby,a.j.(1993).curr.biol.3,327-32；和(5)yates,j.r.,3rd,speicher,s.,griffin,p.r.和hunkapiller,t.

2、(1993).anal biochem 214,397-408。

3、该方法取得了巨大成功并被广泛使用。w.j.,henzel,c.watanabe和j.t.stults给出了题为“蛋白质鉴定：肽质量指纹图谱的起源”(“protein identification:the originsof peptide massfingerprinting”)的详细历史性综述(j am soc mass spectrom.2003,14,931-942)。

4、在2004年的asms教程中，john cottrell教导了：“肽质量指纹图谱只能用于纯蛋白质或非常简单的混合物。用具有高特异性的酶消化蛋白质；通常为胰蛋白酶，但任意的特异性的酶均可使用。通过质谱分析肽的混合产物。这会产生分子质量值的集合，可利用搜索引擎在蛋白质序列数据库中检索这些值。对于蛋白质数据库中的各项目，搜索引擎会模拟已知的酶切割特异性，计算预期的肽的质量，并将计算得到的质量值的该集合和实验质量值的集合进行比较。将某种评分用于鉴定可提供最佳匹配的数据库中的项目，同时生成报告。”

5、因此，肽质量指纹图谱仅利用了肽的质量。强度通常不起作用，因为强度几乎不能通过计算机的虚拟切割程序计算。john cottrell：“在肽质量指纹图谱中，峰的质量值是最重要的。峰面积或强度值是肽碱度、长度和一些其他物理及化学参数的函数。没有特殊理由可假设大的峰是需要关注的而小的峰是不需要关注的......质量的准确度很重要，但覆盖率同样重要。大量质量值具有中等准确度比一个或两个质量值具有极高准确度要更好。

6、网络上可得到的肽质量指纹图谱程序有六个以上，且文献中描述了更多种。

7、与仅使用质量值相比，k.c.parker提出尝试考虑计算出的峰强度：“maldi肽质量指纹图谱中的评分方法：chemscore和chemapplex程序”(“scoring methods inmaldipeptide mass fingerprinting:chemscore,and the chemapplex program”，j amsoc mass spectrom 2002,13,22-39)。作者描述了一个基于计算出的参数(结合蛋白质评分)的软件程序(chemapplex)，该程序将(1)峰强度、(2)匹配的质量准确度和(3)理论强度因子chemscore考虑在内，所述理论强度因子基于化学因素(特别是肽的氨基酸组成以及跨越切割位点的氨基酸的氨基酸序列)的组合，从而估计观察到特定的肽的概率。

8、出版物us2007/0092926 a1(m.a.alterman和b.a.kornilayev；2007)描述了将“独特的蛋白水解肽”应用于肽质量指纹图谱。术语“特殊的蛋白水解肽”(distinctiveproteolytic peptide)或“独特的蛋白水解肽”(unique proteolytic peptide)包括由通过蛋白酶蛋白水解切割蛋白质形成的肽键连接的氨基酸亚基组成的化合物，其不同于任何其他源于利用相同蛋白酶的其他蛋白质消化生成的蛋白水解肽。当参考swissprot或ncbi数据库时，特殊性(distinctiveness)或独特性(uniqueness)优选涉及整个基因组，并且最优选涉及人类基因组。可以通过预测蛋白酶的切割位点来确定肽的边界。

9、如出版物us2005/0153380 a1(n.p.everett等人,2005)所述的靶蛋白的定性和定量分析基于“特征肽”，用于同样的目的。从混合物中提取并浓缩靶蛋白。浓缩的合适方法的实例包括使用固相支持树脂(例如，离子交换剂、亲和凝胶和其他吸附蛋白质的树脂)。术语“特征肽质量”是指由一种或多种特定蛋白质靶标生成的肽质量，其可用来鉴定蛋白质靶标。来源于指定肽质量指纹图谱的容易电离且质量分辨率和准确度高的肽质量被认为是指定靶标的特征诊断性肽质量的集合的成员。对于各蛋白质，图案是独特的，因此是特殊的。

10、考虑到生物药剂的开发(例如，克隆选择)和生产(例如，fill

11、&finish操作中的快速鉴定试验)需要在短的返回时间内进行快速且可靠性高的分析，以加速决策制定并降低成本。在生物药剂的生产过程中可能出现几种具有较高相似度的产物分子从而增加复杂性。例如，不能够基于从常用的肽质量指纹图谱中获取的序列覆盖对同类别的不同治疗性抗体(例如，igg1κ)进行可靠的区分，并且目前需要lc-ms或专用elisas以实现特异性识别。将描述一种可特异性应用于高度相关分子(单克隆抗体，如赫塞汀或阿达木单抗)的集合的快速且可靠的方法。

技术实现思路

1、第一方面，本发明提供了一种表征靶蛋白的方法，包括以下步骤：提供参考蛋白的已测定的参考质谱的文库，其中对于一个参考蛋白的酶消化产物，获取各参考质谱，并且对于所有参考蛋白，酶消化条件大致相同；在用于参考蛋白的相同条件下，对靶蛋白进行酶消化；获取酶消化后的靶蛋白的质谱；确定该质谱和参考质谱的强度图案的相似性得分；以及通过将靶蛋白与参考蛋白进行匹配来表征靶蛋白，该参考蛋白的参考质谱的相似性得分高于预定阈值。靶蛋白通常是来自待表征样品的蛋白质。

2、本方法比较了测得的质谱的质量位点和强度与文库中已测定的参考蛋白的参考质谱的质量位点和强度的相似性。本方法的一个具体优点在于：考虑了以下情况：对于两个高度相似的参考蛋白的谱图，即使利用相同的消化肽进行消化，由于两者的消化肽的相对强度不同，两者的强度图案也可能不同。优选通过余弦相似性度量或互相关来确定相似性得分。

3、酶消化优选使用胰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶(ides)和lys-c中的至少一种。在酶消化之前，通过还原剂并通过变性剂对靶蛋白和参考蛋白进行相同的变性。变性和酶消化可在30分钟之内进行，甚至可以短于15分钟。优选地，使用具有三氟乙醇(tfe)的二硫苏糖醇(dtt)作为变性溶液。

4、优选通过maldi-tof质谱仪获取消化后的靶蛋白的质谱和参考质谱。更优选地，maldi-tof质谱仪包括反射器。maldi-tof质谱仪可为覆盖区小于一平方米且高度小于1.5米的台式仪器。

5、在一个优选实施方案中，参考蛋白具有不同的氨基酸序列，并且参考蛋白的酶消化产物包含具有相应的参考蛋白的特征质量的消化肽。通过与参考蛋白之一进行匹配来鉴定靶蛋白。例如，可以通过亲和捕获从复杂的样品混合物中提取靶蛋白。复杂的混合物可以是尿液、血浆、血清、脊髓液和裂解后的组织细胞之一。优选地，利用抗体进行亲和捕获。

6、在另一个实施方案中，靶蛋白是生物药剂，特别是来自产品的生物药剂。在这种情况下，参考蛋白是靶生物药剂的不同的蛋白质异构体，它们通过选择性剪接、序列变异、转录后修饰和应力诱导的修饰中的至少一种而形成。通过与参考蛋白之一进行匹配从而将靶蛋白鉴定为异构体之一。转录后修饰可以是糖基化、氧化、乙酰化和酰胺化中的至少一种。

7、在另一个实施方案中，靶蛋白是抗体，特别是来自产品的抗体。在这种情况下，参考蛋白是抗体的不同的修饰体。将靶蛋白和参考蛋白通过酶消化成为结构域，并且通过与参考蛋白之一进行匹配从而将靶蛋白鉴定为经修饰的。修饰可以是糖基化、氧化、乙酰化和酰胺化中的至少一种。优选地，利用ides制备fc/2抗体结构域，用于聚糖谱分析(glycoprofiling)。参考蛋白可以为所需抗体，并且通过与该参考蛋白进行匹配从而将靶蛋白鉴定为所需抗体。

8、优选地，本方法进一步包括移除存在于大部分已测定的参考质谱中的冗余质量信号，并且在确定步骤中提供和/或使用缩减的参考质谱。缩减集合优选包括大约三到十五个质量信号。如果参考蛋白具有不同的氨基酸序列，则缩减的参考质谱优选仅包括作为相应的参考蛋白的特征的消化肽的质量信号。缩减的参考质谱可另外包括一些冗余质量信号，这些冗余质量信号存在于基本上所有或很多参考质谱中，并且这些冗余质量信号的数量少于特征质量信号的数量。多变量统计方法被用于确定文库的已测定的参考质谱的冗余质量信号。多变量统计方法优选为主成分分析(pca)、层次聚类(hc)、受试者工作特性曲线(roc)和概率潜在语义分析(plsa)之一。

9、第二方面，本发明提供了表征靶宿主细胞的蛋白质的方法，包括以下步骤：提供参考宿主细胞蛋白质的已测定的参考质谱的文库，其中各参考质谱包括消化肽的质量信号，所述消化肽通过一种参考宿主细胞的蛋白质的酶消化而产生，并且在酶消化之后，通过使用多种亲和剂进行亲和捕获来提取消化肽；在参考宿主细胞的蛋白质所使用的相同条件下，对靶宿主细胞的蛋白质进行酶消化，然后通过使用多种亲和剂进行亲和捕获来提取消化肽；获取所提取的靶宿主细胞的消化肽的质谱；确定该质谱和参考质谱的强度图案的相似性得分；以及

10、通过将靶宿主细胞的蛋白质与某种参考宿主细胞进行匹配表征靶宿主细胞，该参考宿主细胞的参考图谱的相似性得分高于预定阈值。

11、本方法比较了测得的质谱的质量位点和强度与文库中已测定的参考质谱的质量位点和强度的相似性。这种方法的一个具体优点在于：考虑了以下情况：两个高度相似的参考质谱的谱图可能包括在相同质量位点处的质量信号，但强度图案不同，这主要是由于消化肽不同的相对强度所致。优选通过余弦相似性度量或者互相关来确定相似性得分。