一种高灵敏度ELISA法检测人血清中水痘-带状疱疹病毒gE蛋白特异性IgG抗体的方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种高灵敏度elisa法检测人血清中水痘-带状疱疹病毒ge蛋白特异性igg抗体的方法。

背景技术：

1、水痘-带状疱疹病毒(vzv)是引起人类水痘(chickenpox)和带状疱疹(herpeszoster)疾病的病原体，属疱疹病毒科，是双链dna病毒；vzv病毒颗粒呈准圆球形，直径有150～200nm，由内及外分为四层，依次为病毒核心、核衣壳、皮层和囊膜。在病毒的囊膜上包含至少9种糖蛋白，包括ge、gb、gh、gi、gc、gl、gk、gm和gn，这些糖蛋白在病毒感染宿主中发挥重要作用。

2、目前最为有效的避免感染该病毒的方法为免疫接种疫苗。当前，vzv疫苗主要有减毒疫苗、重组蛋白疫苗，在研的还有核酸疫苗；1974年，日本的高桥理明建立了水痘减毒病毒oka株，世界卫生组织认为，目前只有oka株适用于水痘减毒活疫苗的制备，世界各国均采用oka株水痘减毒活疫苗预防和控制水痘，研究表明，oka株在传代至50代，生物学特性依然保持良好的稳定性。

3、目前，用于预防带状疱疹病毒的疫苗主要是gsk的亚单位疫苗(shingrix，欣安立适)和长春百克的减毒活疫苗；shingrix疫苗是由vzv中抗原性最强，含量最高的ge糖蛋白和as01b佐剂系统构成，可以激发机体强烈的细胞免疫和体液免疫；通过查看fda发布shingrix的review，在疫苗免疫原性评价方面其主要关注了anti-ge antibody水平(elisa)、ge特异性细胞因子水平(ics)，这两个指标被作为该疫苗免疫原性效果的主要终点指标；在其一项iii期临床试验中，gsk建立了一套cut-off值为97miu/ml(即阳转判断阈值)的elisa方法检测其临床样本；同时，在细胞免疫评价方面，gsk评估了生物样本中满足至少2个特异性细胞因子水平的cd4+细胞比例，即the frequencies of glycoprotein e-specific cd4[2+]t cells。其cut-off为320cd4[2+]t cells per 106cd4 t cellscounted。

4、查看cde关于gsk“重组带状疱疹疫苗(jxss1800039)申请上市技术审评报告”可以发现，cde并不支持gsk使用anti-ge antibody水平(elisa)用于直接推断保护效力，仅能用于参考；因此，fama法作为水痘特异性抗体检测的“金标准”，在国内越来越受到监管层的重视。

5、而水痘-带状疱疹病毒疫苗免疫原性研究主要关注的糖蛋白抗体为ge蛋白抗体，也有研究者对gb和gh蛋白抗体进行了检测，而fama法则可以检测针对vzv的全部特异性的igg抗体，其灵敏度、特异性等均优于elisa法；但fama法检测过程较复杂，通量低，重现性相比elisa更难，因此，国内临床试验一般均会使用两种方法对疫苗的体液免疫进行评价，监管机构也利用临床试验数据评估两种方法的相关性，以评估疫苗免疫原性。

6、建立的elisa法检测ge抗原特异性抗体水平的方法使用nibsc国际标准品配制标准曲线样本和质控样本，如果是非临床评价则需要阳性血清或阳性抗体；将重组vzv-ge蛋白包被于酶标板上，封闭后加入标品、质控品以及待测样品孵育，再次加入抗人igg二抗，最后洗板后tmb显色，以国际标准品来计算待测样品中的vzv-ge蛋白特异性igg抗体浓度。

7、fama法同样需要使用则是利用将感染了vzv病毒的细胞固定在载玻片上，加入标品、待测样品孵育，加入荧光二抗后显微镜下观察，呈荧光圆环的孔为阳性孔；其结果判定可依据一定数量的阴性血清孔检测结果进行判定，临床上一般以≥1：4判定为阳性，即具有vzv保护力。

8、在方法学验证方面，目前文献中主要是方法学的建立而缺少系统性的方法学验证；中国食品药品检定研究院发表过相关的vzv igg抗体国家标准品制作和验证的文献，其使用nibsc国际标准品对中检院阳性参考品进行赋值，以评估vzv相关体外诊断试剂盒性能；周志军等等使用商品化试剂盒对vzv病毒igg检测方法进行了验证，其验证主要内容包括线性及线性范围、精密度和准确度、添加试验等，但其验证指标无法满足临床试验申报要求；根据ich m10及2020年版《中国药典》要求，配体结合定量分析方法验证至少包括校准曲线和范围、准确度和精密度、特异性、选择性、稀释线性和钩状效应、稳定性等，并且还应对样品进行isr；而定性抗体检测方法则按照《疫苗临床试验抗体分析方法研究技术指导原则(征求意见稿)》进行cut-off值、专属性、检测限，定量和半定量检测方法则应进行专属性、检测限、线性、线性范围、准确度和精密度的验证。

9、对于fama的方法学验证则缺乏国家标准，一般来说可以参考相关文献进行开展，但其总体上应尽量遵循抗体检测相关指导原则，袁典等对建立的fama法进行了灵敏度、特异性、重复性、准确度的验证，其灵敏度达到31.25miu/ml，gsv％分别为29.95％和26.71％，同时特异性验证总发现未与hsv-1/2型抗体发生交叉反应，证明特异性良好。

10、park r，hwang jy,leeki等考虑到fama需要p2实验室培养病毒，尝试建立一种基于ge蛋白的fama，但这种方法很难获得监管层的认可；liu jj等使用fama对实验室592份血清进行分析检测，但是方法建立后仅对灵敏度和特异性进行了验证；michalik de等使用elisa和fama对临床试验148名儿童血清样本进行了检测，其未对fama方法学验证指标进行描述。

11、综上所述，现有针对人血清中水痘-带状疱疹病毒ge蛋白特异性igg抗体的检测方法无法同时满足高灵敏度、特异性优以及通量高，重现性优的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高灵敏度elisa法检测人血清中水痘-带状疱疹病毒ge蛋白特异性igg抗体的方法，旨在解决现有技术中针对人血清中水痘-带状疱疹病毒ge蛋白特异性igg抗体的检测方法无法同时满足高灵敏度、特异性优以及通量高，重现性优的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明采用的一种高灵敏度elisa法检测人血清中水痘-带状疱疹病毒ge蛋白特异性igg抗体的方法，包括以下步骤：

3、抗原包被：用1×pbs磷酸盐缓冲液将含量为2170μg/ml的ge蛋白稀释至0.5μg/ml，按100μl/孔加入96孔板中，低温过夜；

4、洗板：取出包被过夜的酶标板，弃去孔内液体，拍干后洗液300μl/孔加入，静置后拍干，重复三次；

5、封闭：封闭液300μl/孔加入，盖上封板膜孵育；

6、重复洗板过程；

7、加样：配制好的质控样本100μl/孔加入，盖上封板膜孵育；

8、重复洗板过程；

9、加酶：酶工作液100μl/孔加入，盖上封板膜孵育；

10、重复洗板过程；

11、显色：tmb 100μl/孔加入，盖上封板膜避光显色；

12、终止：终止液50μl/孔加入，轻微振荡；

13、读数：在450nm波长下读取od值。

14、其中，低温过夜的温度为2-8℃。

15、其中，在取出包被过夜的酶标板，弃去孔内液体，拍干后洗液300μl/孔加入，静置后拍干中，静止的时间为1min。

16、其中，在封闭液300μl/孔加入，盖上封板膜孵育中，孵育过程于37℃，400rpm条件下孵育2h。

17、其中，在配制好的质控样本100μl/孔加入，盖上封板膜孵育中，孵育过程于37℃，400rpm条件下孵育1h。

18、其中，在酶工作液100μl/孔加入，盖上封板膜孵育过程中，孵育于37℃，400rpm条件下孵育30min。

19、其中，在tmb 100μl/孔加入，盖上封板膜避光显色中，避光显色于37℃，400rpm条件下避光显色15min。

20、本发明的一种高灵敏度elisa法检测人血清中水痘-带状疱疹病毒ge蛋白特异性igg抗体的方法，本方法采用重组vzv-ge蛋白包被酶标板，自建间接elisa方法，通过对包被浓度、封闭条件、孵育时间、二抗浓度等进行筛选，成功建立人血清中vzv-ge蛋白igg抗体浓度检测方法；继而使用该方法和nibsc国际标准品(nibsc code：w1044)对阳性混合人血清进行标定，标定后的阳性混合血清作为企业标准品，以用于测定人血清中的vzv-ge蛋白特异性igg抗体浓度；

21、以此方式解决了现有技术中针对人血清中水痘-带状疱疹病毒ge蛋白特异性igg抗体的检测方法无法同时满足高灵敏度、特异性优以及通量高，重现性优的技术问题。