一种广谱抗菌芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种广谱抗菌芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.镰孢菌(fusarium spp.)是一类重要的真菌，具有种类多、易变异、种内生理分化明显等特点，其广泛分布于自然界中，以兼性寄生或腐生方式生活。有些种类可引起番茄、黄瓜、辣椒、茄子、草莓等多种蔬菜水果的根部病害，是土壤中常见的一类重要植物病原真菌。
3.随着现代农业的快速发展，一些高附加值的蔬菜水果得到集约化发展，高复种指数以及化肥农药的不规范使用，导致病虫害病原富集，连作障碍问题日益突出。其中土壤中镰孢菌选择性成为土壤中的优势病原真菌，占根际真菌组成的90％以上，虽然多数种类不会直接侵染发病，但大量的镰孢菌依然对其它有益微生物造成种群竞争压力，更有可能成为机会致病菌，加重危害，是一类重点防控的植物病原真菌。用微生物技术，筛选生防菌，抑制土壤中镰孢菌种群，强化有益微生物优势，对于防治植物根部病害具有重要的意义。
4.芽孢杆菌是植物和土壤环境微生态区系的优势种群，许多优良菌株表现出对多种植物病原菌具有拮抗作用，其繁殖能力强，耐热、耐酸碱和紫外线，抑菌谱广泛，为目前主要的生防菌株。目前合法报道的芽孢杆菌种类有102种，应用于生物防治研究中的芽孢杆菌的种类仅限于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)及多粘芽孢杆菌(bacillus polymyxa)等少数几个种类。因此挖掘更多的生防芽孢杆菌菌种资源对于植物的生物防治研究及应用有着重要的意义。


技术实现要素：

5.针对应用于生物防治研究中的芽孢杆菌的种类相对匮乏的技术问题，本发明提供一种广谱抗菌芽孢杆菌及其应用，该广谱抗菌芽孢杆菌分离筛选自设施蔬菜土壤，对土壤的理化环境具有更好的适应性，针对土壤中优势病原种群镰孢菌广谱抗病，可通过抑制其种群优势，达到预防和减少病害的效果。
6.第一方面，本发明提供一种广谱抗菌芽孢杆菌，所述广谱抗菌芽孢杆菌为耐旱芽孢杆菌b2-12，所述耐旱芽孢杆菌b2-12已于2021年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.23577，分类命名为bacillus inaquosorum。
7.第二方面，本发明提供一种上述广谱抗菌芽孢杆菌在调控土壤中镰孢菌种群和/或防治土传病害上的应用。
8.进一步的，所述镰孢菌选自尖孢镰孢菌(fusarium oxysporum)、茄病镰孢菌(f.solani)、藤仓镰孢菌(f.fujikuroi)、木贼孢菌(f.equiseti)、共享镰孢菌
(f.commune)、镰孢霉菌(f.delphinoides)、轮纹镰孢菌(f.concentricum)、三线镰孢菌(f.tricinctum)。
9.进一步的，所述土传病害由以下病原真菌中的至少一种引起：
10.尖孢镰孢菌(fusarium oxysporum)、茄病镰孢菌(f.solani)、藤仓镰孢菌(f.fujikuroi)、木贼孢菌(f.equiseti)、共享镰孢菌(f.commune)、镰孢霉菌(f.delphinoides)、轮纹镰孢菌(f.concentricum)、三线镰孢菌(f.tricinctum)。
11.进一步的，所述应用为使用耐旱芽孢杆菌b2-12的可湿性粉剂对蔬菜进行灌根处理。
12.进一步的，所述可湿性粉剂的制备方法为：用灭菌的硅藻土或草炭土吸附耐旱芽孢杆菌b2-12的发酵液，得到可湿性粉剂。
13.进一步的，所述发酵液的制备方法包括如下步骤：
14.(1)使用lb培养基活化耐旱芽孢杆菌b2-12；
15.(2)然后将活化后的耐旱芽孢杆菌b2-12转接到液体种子培养基中，于28-30℃条件下，180r/min振荡培养24h，得种子液；
16.(3)将种子液按5％比例接种到液体发酵培养基中，于罐压0.04-0.06mpa、温度28
±
2℃、通气量1：0.8-1.2条件下，120r/min搅拌培养36-48h，得发酵液。
17.进一步的，所述可湿性粉剂中，耐旱芽孢杆菌b2-12的有效活菌数≥20
×
108cfu/g。
18.本发明的有益效果在于：
19.本发明从棚龄超过20年的设施番茄土壤中分离的一株对镰孢菌有较强的抑菌效果的耐旱芽孢杆菌b2-12，该菌株在土壤中有较高的分离频率，其对集约化设施栽培土壤环境具有很强的适应性，通过对镰刀菌(fusarium spp.)高效的抑制作用，从而调控土壤微生物种群结构及种群数量，预防或减少病害的发生，替代化学杀菌剂的使用。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1是耐旱芽孢杆菌b2-12对尖孢镰孢菌的抑菌效果。
22.图2是耐旱芽孢杆菌b2-12对土壤中几种镰孢菌种群的抑制效果柱状图。
具体实施方式
23.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
24.本发明具体实施方式中所使用的液体种子培养基配方为淀粉5.0g、酵母粉1.0g、k2hpo
4 2.0g、mgso4·
7h2o 0.5g、caco
3 0.1g、feso4·
6h2o 0.005g、水1000ml，液体种子培
养基ph值控制在7.4-7.5。
25.本发明具体实施方式中所使用的液体发酵培养基中含有蔗糖10g、玉米粉40g、大豆蛋白粉10g、酵母粉2g、(nh4)2so
4 2g、mgso
4 0.2g、caco
3 1g、k2hpo
4 1g、kh2po
4 1g、水1000ml，液体发酵培养基ph值控制在7.4-7.5。
26.本发明具体实施方式中所使用的lb培养基配方为蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl 5g、水1000ml，lb培养基ph值控制在7.2-7.4。
27.本发明具体实施方式中所使用的na培养基配方为蛋白胨10g、nacl 5g、牛肉膏3g、琼脂粉15g、水1000ml，na培养基ph值控制在7.2-7.4。
28.实施例1 菌株的分离
29.对山东寿光一棚龄超过20年的设施番茄的番茄根围土样进行取样，稀释106倍，取1ml涂na固体培养基平板，28℃培养3天，挑取细菌菌落，依次与尖孢镰孢菌(fusarium oxysporum)、茄病镰孢菌(f.solani)、藤仓镰孢菌(f.fujikuroi)、木贼孢菌(f.equiseti)、共享镰孢菌(f.commune)、镰孢霉菌(f.delphinoides)、轮纹镰孢菌(f.concentricum)、三线镰孢菌(f.tricinctum)对峙培养，筛选对几种病原真菌有广谱抑菌活性的菌株。
30.挑取对所有供试病原真菌均有较强抑菌活性的菌株b2-12，16s rdna序列(genbank：ok626405)提交ncbi blast进行相似性比较，与bacillus inaquosorum nrrl b-23052(genbank：eu138467)相似性达99.91％，结合形态新特征，鉴定该细菌菌株为bacillus inaquosorum(耐旱芽孢杆菌)。
31.实施例2 抑菌试验
32.(1)将尖孢镰孢菌(fusarium oxysporum)、茄病镰孢菌(f.solani)、藤仓镰孢菌(f.fujikuroi)、木贼孢菌(f.equiseti)、共享镰孢菌(f.commune)、镰孢霉菌(f.delphinoides)、轮纹镰孢菌(f.concentricum)、三线镰孢菌(f.tricinctum)分别接种在pda培养基上活化2天。
33.(2)用灭菌的直径5mm的打孔器于各病原真菌菌落边缘打取菌苔，分别移置于直径9cm的na培养基上，同时将耐旱芽孢杆菌b2-12用牙签挑取少许点平板另一侧(与病原真菌菌饼6cm)，25℃条件下对峙培养，每处理重复3次，以只接病原菌的为对照。
34.(3)待对照病原菌菌落快长到链霉菌接菌点时，测量各自菌落的半径，并计算抑制率，结果如图1、表1所示，耐旱芽孢杆菌b2-12对几种供试病原真菌具有广谱抑菌活性。
35.表1耐旱芽孢杆菌b2-12对几种土传植物病原真菌的对峙试验
[0036][0037]
实施例3 发酵液的制备
[0038]
(1)将耐旱芽孢杆菌b2-12接种到lb培养基活化；
[0039]
(2)将活化后的耐旱芽孢杆菌b2-12转接至液体种子培养基中，控制培养温度保藏在28-30℃范围内，180r/min振荡培养24h，得种子液；
[0040]
(3)将种子液按5％比例接种到液体发酵培养基中，控制发酵条件保藏在罐压0.04-0.06mpa、温度28
±
2℃、通气量1：0.8-1.2范围内，120r/min搅拌培养36h，得发酵液。
[0041]
实施例4 可湿性粉剂的制备
[0042]
将发酵液用灭菌的硅藻土或草炭土按15％-20％的比例吸附，调整有效活菌数≥20
×
108cfu/g，即得可湿性粉剂。
[0043]
实施例5 发酵液对常见土传病害的防治试验
[0044]
土壤取自济阳某日光温室，试验前混入各种镰孢菌，常温下保湿培养30天后进行盆栽试验。试验用一次性纸杯(9cm
×
7.3cm
×
7.3cm)，每个纸杯装干土150g。将实施例4制备的耐旱芽孢杆菌b2-12可湿性粉剂用清水稀释200倍，加入带土纸杯，以完全浸透盆内土壤且不外溢为准，间隔7天，连续3次。以不加耐旱芽孢杆菌b2-12可湿性粉剂的为对照，每处理50次重复，每盆种番茄种子5粒(出苗后统一留下2棵)。温室培养30天，统计番茄病害发病率，计算防病效果。
[0045]
结果如表2所示，用耐旱芽孢杆菌b2-12可湿性粉剂对镰胞菌引起的病害具有较高的防治效果。
[0046]
表2可湿性粉剂对几种土传病害的防治效果
[0047][0048]
将番茄连根拔起，取根际土壤，用无菌水依次稀释100或1000倍，各取1ml稀释液涂pda培养基平板，各稀释梯度设20个重复，28℃培养2-4天，挑取所有真菌菌落，转接pda培养基上培养，根据供试植物病原真菌的菌落特征，统计其分离频率，估算种群密度，计算抑制
率。结果如图2所示，耐旱芽孢杆菌b2-12对镰胞菌具有抑制效果。
[0049]
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。