与苹果树分枝角度相关基因关联的分子标记及其应用

1.本发明涉及分子遗传育种技术领域，特别涉及与苹果树分枝角度相关基因关联的分子标记及其应用。


背景技术：

2.苹果(malus
×
domestica borkh.)是世界范围内重要的经济果树，位居水果生产的第三位。我国是苹果生产大国，栽培面积和产量均占世界面积和产量的50％以上。但我国苹果单位面积产量低、优质果等级率低、果园管理成本高等因素制约了我国苹果产业发展(束怀瑞和陈修德2018；程存刚和赵德英2019)。果树树型结构(tree architecture)不仅影响栽植密度、叶幕和开花结果能力，也影响田间管理等生产成本投入(hill&hollender 2019)。选育兼具“理想树型和优良果实品质”的新品种，是解决生产栽培问题的根本。果树自然生长的树形是由树体自身分枝特性决定的，受遗传基因控制。挖掘分枝相关基因及分子标记，为创建出生产效率高、适于机械化管理的理想树型，提供理论基础和技术支撑。
3.植物枝条系统包括主枝和侧枝，植物的分枝角度(侧枝与其萌生枝干之间的角度)包括基角(crotch angle)、主干与枝生长方向之间的平衡角(equilibrium angle)或倾斜角(inclination angle)或重力设置角度(gravitational set point angle)和活跃生长侧枝最先端的地性角(geotropic angle)。苹果的枝条(茎)具有直立向上生长的特性，分枝角度小的枝条垂直优势强，树冠向内抱合生长，导致树冠郁闭、开花结果不良。开张角度改变枝条生长方向，缓和生长势，可以促进开花结果(吕珍珍等2018，costes et al.,2010)。中国果树志苹果卷中根据树姿可将苹果品种按照分枝角度划分直立(＜40
°
)、半开张(40
°‑
65
°
)、开张(66
°‑
85
°
)和极开张或下垂(＞85
°
)(贾定贤等，1999)。根据对苹果多年生果树的观察，在以
‘
威赛克’等柱型后代的分枝角度为29.22
°
(
±
6.52se)，以
‘
金冠’等普通品种的分枝角度为47.29
°
(
±
6.81se)，以澳洲青苹等具有垂枝性状的分枝角度为76.56
°
(
±
7.73se)。综上，本专利将苹果果树定义为分枝角度小(≤30
°
)、中(30
°‑
60
°
)、大(≥60
°
)。
4.tiller angle control1(tac1)是调节植物分枝角度中的关键基因，在栽培水稻中首次克隆(yu et al.,2007)先后在拟南芥(jin et al.,2008)、玉米(ku等(2011))、桃(dardick et al.,2013)和苹果(wang et al.,2018)中鉴定了该基因。本课题组前期以苹果四种典型树型的代表性品种
‘
威赛克’、
‘
旭’、
‘
福岛短枝’和
‘
澳洲青苹’为试材，利用同源克隆的方法，从苹果基因组中克隆了mdtac1a、mdtac1b，其分别位于chr1、7。这些品种在cds区域仅存在snp(single nucleotide polymorphism)差异，在启动子(2.0kb)序列存在snp和indel(insertion-deletion)，导致不同品种中基因表达的差异性(wang et al 2018)。
5.目前，可用于对苹果分枝角度选育的分子标记未见报道，利用这对标记进行辅助选择可提高生产筛选效率，加速育种进程。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了与苹果树分枝角度相关基因关联的分子标记及其应用，
采用本发明对苹果进行鉴定，聚丙烯凝胶电泳结果和预期基因型相符率为95.29％。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了indel分子标记在鉴定、区分和/或预测苹果分枝角度中的应用。所述indel分子标记位于苹果基因组7号染色体的mdtac1a基因的启动子上，序列为gagaga。
9.在本发明的一些具体实施方案中，所述鉴定、区分和/或预测苹果分枝角度的标准为：
10.如果存在gagaga序列或出现370bp条带，所述苹果分枝角度＜30
°
，或30
°
≤所述苹果分枝角度＜60
°
；
11.如果缺失gagaga序列或出现364bp条带，所述苹果分枝角度≥60
°
。
12.本发明还提供了扩增所述indel分子标记的引物组。
13.在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组包括：
14.(i)、正向引物，具有如seq id no.2所示的核苷酸序列；和/或
15.(ii)、反向引物，具有如或seq id no.3所示的核苷酸序列；和/或
16.(iii)、具有如(i)或(ii)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(i)或(ii)所示的核苷酸序列功能相同或相似；和/或
17.(iv)、具有与如(i)～(iii)任意所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
18.所述多个为2个～10个。
19.在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的引物组的核苷酸序列与上述引物组的核苷酸序列的同源性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
20.在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的修饰为成倍扩增。
21.在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的取代为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
22.在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的缺失为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
23.在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的添加为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
24.本发明还提供了试剂盒，包括所述引物组以及可接受的辅料和/或助剂。
25.在本发明的一些具体实施方案中，所述的辅料或助剂包括2
×
green taq mix、dmso、tmac、ssb、甲酰胺、海藻糖、甜菜碱、非离子型洗涤剂、dntps、udg酶、tth酶和/或mgcl2。
26.本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒在鉴定、区分和/或预测苹果分枝角度和/或选择育种中的应用。
27.本发明还提供了鉴定、区分和/或预测苹果分枝角度的方法，所述鉴定、区分和/或预测苹果分枝角度的标准为：
28.如果存在gagaga序列或出现370bp条带，所述苹果分枝角度＜30
°
，或30
°
≤所述苹果分枝角度＜60
°
；
29.如果缺失gagaga序列或出现364bp条带，所述苹果分枝角度≥60
°
。
30.在本发明的一些具体实施方案中，所述方法包括如下步骤：
31.步骤(a)、引物设计：设计并筛选，得到引物组；
32.步骤(b)、dna提取：提取待检测苹果总dna；
33.步骤(c)、pcr扩增：以步骤(b)获得的所述总dna为模板，采用步骤(a)所述的引物组进行pcr扩增，获得pcr产物；
34.步骤(d)、电泳图谱分析：对所述pcr产物进行电泳，根据条带大小及位置关系确定所属基因型。
35.在本发明的一些具体实施方案中，所述方法还包括生物信息学方法和/或分子生物学方法；
36.所述生物信息学方法包括：
37.获得待测苹果基因组7号染色体的mdtac1a基因的启动子上的序列，根据该序列判断是否存在gagaga序列，从而推测待测苹果分枝角度；
38.所述分子生物学方法包括：
39.获得具有待测苹果基因组7号染色体的mdtac1a基因的启动子上的序列的核酸，通过核酸扩增、探针结合或电泳，间接判断该序列是否存在gagaga序列，从而推测待测苹果分枝角度。
40.在本发明的一些具体实施方案中，所述方法的步骤(c)中所述引物组中任一引物的浓度均不小于10μmol/l；
41.步骤(c)中所述pcr扩增的反应体系包括100ng/μl苹果总dna 2μl、正向引物1μl、反向引物1μl、2
×
green taq mix 10μl、ddh2o 6μl；
42.反应程序为：
[0043][0044]
本发明还提供了选择育种的方法，包括使用所述方法对苹果进行选择育种。
[0045]
本发明有如下效果：
[0046]
1、开发的indel分子标记可鉴定、区分和/或预测苹果分枝角度。该indel分子标记在分枝角度小(≤30
°
)、中(30
°‑
60
°
)树型保持一致，而大分枝角度(≥60
°
)树型存在6bp的缺失，缺失序列为gagaga。
[0047]
2、本发明建立了鉴定、区分和/或预测苹果分枝角度的方法。对23份苹果常见栽培种及62份金蕾1号与澳洲青苹f1代杂交种(共计85份)进行验证，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pcr扩增产物，对所获得的区分苹果分枝角度大小的多态性片段进行分析，结果和预期基因型相符率为95.29％。
附图说明
[0048]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0049]
图1(a)示亲本中大分枝角度树型；
[0050]
图1(b)示亲本中小分枝角度树型；
[0051]
图1(c)示不同品种的分枝角度统计；
[0052]
图2示indel位点信息图；
[0053]
图3示品种中pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；m代表dna ladder marker；1代表中秋王；2代表红星；3代表爱妃；4代表光辉；5代表红玉香；6代表华硕；7代表维纳斯；8代表黄玉香；9代表秦脆；10代表拓季；11代表露珠；12代表美思；13代表希望；14代表晋州红；15代表瑞香红；16代表锦香红；17代表华佳；18代表华瑞；19代表烟富10；20代表烟富6；21代表烟富8；
[0054]
图4示f1代中不同分枝角度；其中，a示f1代中小分枝角度树型；b示f1代中大分枝角度树型；c示分枝角度统计；d示pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；m代表dna ladder marker；1至29依次代表f1代-1至f1代-29；30代表亲本澳洲青苹；31代表亲本金蕾1号；32至64依次代表f1代-30至f1代-62；
[0055]
图5示sanger测序结果图。
具体实施方式
[0056]
本发明公开了与苹果树分枝角度相关基因关联的分子标记及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0057]
本发明所述的“苹果”是物种层面上的含义，可指苹果物种的单个细胞或多细胞组织，还可指苹果物种的根、茎、叶、花、果实或种子。
[0058]
本发明利用pcr扩增及sanger测序技术的方法在7号染色体检测到与果树分枝角度相关区域，同时结合不同分枝角度品种的测序信息开发及验证indel分子标记，并设计了其引物，在杂交f1代中进行了应用，可为鉴定不同分枝角度的特征提供新手段，加速苹果分枝角度特征性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。利用插入缺失核酸位点设计indel标记作为与不同的分枝角度紧密连锁的分子标记是可以实现的，并且indel标记与ssr标记同样具有变异稳定，多态性强，成本低的优点。
[0059]
具体地，tiller angle control1a(tac1a)为igt家族成员，主要在腋芽组织中表达。本发明在苹果基因组7号染色体的mdtac1a基因的启动子上筛选到一个indel位点。在该indel位点，在分枝角度小(≤30
°
)、中(30
°‑
60
°
)树型保持一致，而大分枝角度(≥60
°
)树型存在6bp的缺失，缺失序列为gagaga。在indel上下游370bp内设计的一对标记引物，为不同分枝角度进行鉴定、辅助分子育种提供依据。进一步开发了indel分子标记，对23份苹果常见栽培种及62份金蕾1号与澳洲青苹f1代杂交种(共计85份)进行了验证，该分子标记能将不同的分枝角度进行分类。本发明提供的分子标记可用于对苹果分枝角度选育，利用这对标记进行辅助选择可提高生产筛选效率，加速育种进程。
[0060]
如未特殊说明，本发明中所用试剂等材料均可通过试剂公司合成和购买，不同的苹果品种及杂交f1代栽种于中国农业大学上庄实验站。
[0061]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0062]
实施例1：位点鉴定及indel分子标记的开发
[0063]
1、材料处理
[0064]
本技术本实施例中，对23份苹果常见栽培种及62份金蕾1号与澳洲青苹f1代杂交种(共计85份)进行了鉴定。对这85份材料在中国农业大学上庄试验基地种植。在生长期进行分枝角度统计(见图1、图3、表1、表2)、叶片组织取样，并将样品迅速置于-80℃保存。
[0065]
表1分枝角度统计
[0066]
品种平均角度(
°
)标注误中秋王54.005.83红星40.336.45爱妃41.006.88光辉77.003.56红玉香58.003.56华硕39.675.31维纳斯50.334.64黄玉香70.004.08秦脆73.335.68拓季53.675.31露珠84.738.19美思76.333.86希望51.334.64晋州红50.334.64瑞香红38.004.40锦香红49.003.74华佳75.334.27华瑞78.003.56烟富十74.334.42烟富六74.674.64烟富八70.873.90
[0067]
表2分枝角度统计
[0068]
品种金蕾1号澳洲青苹f1代小角度f1代大角度平均角度(
°
)32.6988.0835.7787.69标准误2.493.124.744.65
[0069]
采用ctab方法提取每份材料的叶片全基因组dna。具体方法为：
[0070]
1)将1g叶片放入研钵中充分研磨，迅速移至2ml预冷的离心管中，加入1ml 2％ctab，充分混匀。
[0071]
2)65℃水浴1h(每15min摇匀一次)；12000rpm离心5min。
[0072]
3)取上清于新的2ml离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇(体积比24：1)，轻轻颠倒混匀5min，静置5min。
[0073]
4)12000rpm离心10min，取上清于新管中。
[0074]
5)重复3，4步骤一次。
[0075]
6)向上清中加入2倍体积的预冷无水乙醇沉淀dna，-20℃放置2h。
[0076]
7)12000rpm离心10min，倒掉上清。
[0077]
8)加500μl 75％的乙醇清洗2次，去上清；室温下晾干。
[0078]
9)风干后加入100μl的rna酶：ddh2o(1：100,v:v)的混合液溶解dna。
[0079]
采用1％的琼脂糖凝胶电泳及thermo的nanodrop1000来确定dna样品浓度、质量及完整性。
[0080]
2、indel分子标记的开发
[0081]
如图2，在苹果基因组7号染色体的mdtac1a基因的启动子上筛选到一个indel位点。在该indel位点，在分枝角度小(≤30
°
)、中(30
°‑
60
°
)树型中保持一致，而大分枝角度(60
°‑
90
°
)中存在6bp的缺失，缺失序列为gagaga。
[0082]
启动子2000bp序列(seq id no.1)如下：
[0083]
tctccctttcattttgtctttttccttttttttttaaattaataaaaagttgctagtttgatttttcattttattattgattaacttttgccaagctgttgggcatgagcccttggtaccttggagaatagcaggaattgaggacacacgttcccattatattgtgcaatgtattaacctttttggagaaattttatttgatgtgattgaagtttttgcgaattctccaccgaaaggcaaaacagttaaaaacttttgtcacatagatagctatatgttttgtcagtgattcaatattttgtgtttagattagttggtttttccaataaaaaaagattagttggttttttactattagttttgataatcggttgtatactcatattcaaacgtaaagttatagtatttggctcaagacatatatgttaatttgtggtgagtttagtgttttcatgcaatattcaaaacacaaaataggtaatgaaacccctctagttagtcttttgttcaattaatttcgaattgaatcatcacattctaatcgtcttttaaactaattacatagaaaaattattgtgagatgaaaccatgaatcatgtatgtacatttgctttagaactttacagtattatataggttgatccaaaagttgattacttctggttggttatttttcttgtaggacttttttttcttggatctgataaattacaaagatatggatttgtgaatgaaacctatgtgttgcatttgtgggtgtttgaaattgtgtttttgtttcatgcatatcacactacttatgaaactacaacaaaattacacgctatttctgaaactgaaccaaaatattctacattatttctgaaactacaacaaaataaacaacattcttctattttcatgccttctcttccttctatcattttctttttctcctcttctcagtctaccatagcagatggaaattttgataagttttgataaaatttgaagtatcttaaaacctacagcagcaacttgagttacatgataagtctaaaagaatttggttgctttgtcaaatttacaaactttaacttttttcccagaaaactaaccaagattccatgcttcaaattccatatatcgaaaaaaaaccagcaacatgataatccttgtatgcaacctcttgattgttgggcatgaaaaacaaaattgctctaaatctgtgtaataattttcaataaaagaaaacaaattggtgacaagtttatgcagattcatggaaaagaagagagggttggagaagaaaactcaaaaaaagagagaaatagagggtgtaaaagtcaaggtagacattaatgctttgtcatggaaaaagcaaatggaatttaattttcaatcacagttggatttgaataagaaaacgggtttggttggattccgtaaggggcaagtttggaaaaaaatatttactgttgatatgggcttttaatgcagtccatgagttgttatgtttgtagagcttgatacatgaataattgtgtcattatgattaaattttaagtccttatgattaaataatagtttatgatgatttttggttaaattaaggttagcccaattcattttcattaaagcttttaaattttagagatcattgttaaagtttactcttacacaaacttagaacttcattgacaggcggcgggagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagtaattaattaaacacatcttatcaagaatttcggcacatcgatcatgccacagagacccaacatcgtggctcgtcaaagaagccaatgcacccacaaacacaggtgcattttagggccccgctctggacgcgtgtcgttttcagactctgcaacccacttggcccctgcccttttattctggtactcataattattcctcttcagtttgtgtttcagtcgctggggctttgctctgataattggcaactttgctcag
aaaaat
[0084]
根据引物设计原则，本技术在所述indel位点上下游370bp内用primer 5设计了一对indel标记引物，包括一条正向引物序列和一条反向引物，引物序列为：f：ggttaaattaaggttagcccaattc(seq id no.2)，r：aattatcagagcaaagccccag(seq id no.3)。
[0085]
实施例2：indel标记引物的应用验证
[0086]
以样品全基因组dna为模板，利用开发的indel标记引物pcr扩增反应体系及扩增程序进行pcr扩增，对pcr产物进行聚丙烯凝胶电泳，即可检测分辨不同的等位变异。对23份苹果常见栽培种及62份金蕾1号与澳洲青苹f1代杂交种(共计85份)进行了验证。pcr扩增反应体系总体积为20μl，由6ml ddh2o、10μl 2
×
green taq mix、1μl 10μm的正向引物、1μl 10μm的反向引物和2μl全基因组dna组成。pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s，54.5℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
[0087]
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图3、图4所示：图3中“m”代表dna ladder marker，1.中秋王，2.红星，3.爱妃，4.光辉，5.红玉香，6.华硕，7.维纳斯，8.黄玉香，9.秦脆，10.拓季，11.露珠，12.美思，13.希望，14.晋州红，15.瑞香红，16.锦香红，17.华佳，18.华瑞，19.烟富10，20.烟富6，21.烟富8，图4中p1代表金蕾1号，p2代表澳洲青苹，b代表宽冠f1代，n代表窄冠f1代，综合上述结果，即在大分枝角度(≥60
°
)树型中存在6bp的缺失，而在分枝角度小(≤30
°
)、中(30
°‑
60
°
)树型中没有发现该位点存在缺失现象。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果和预期基因型相符率为95.29％。
[0088]
此外，对这85份的pcr产物进行sanger测序，结果如图5所示：sanger测序结果表明大分枝角度(≥60
°
)中存在6bp的缺失，缺失序列为gagaga，在分枝角度小(≤30
°
)、中(30
°‑
60
°
)树型中在该位点没有存在缺失现象。进一步证明该indel分子标记能将苹果树分枝角度区分开。
[0089]
综上，该indel分子标记可鉴定不同的分枝角度，挑选出不同分枝角度的苹果树型，利用这对标记进行辅助选择可以快速选择育种。
[0090]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。