一种基于rpb2序列杂合位点鉴定茯苓同核、异核菌株的方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于rpb2序列特异杂合位点鉴定茯苓同核、异核菌株的方法。


背景技术：

2.茯苓(pachyma hoelen fr.)是我国传统中药，在多种古药典籍中均有记载，其在中药中配伍率极高，有“十方九茯苓”之说，仅《中华人民共和国药典》2020版收录的含茯苓的中成药就有239种。《神农本草经》记载，茯苓味甘，性平，利小便，久服安魂养神，不饥，延年，并将其列为上品。现代医学研究表明，茯苓菌核含有多种三萜和多糖类成分，具有抗炎症、保肝、抗癌、免疫调节，改善高血糖、高血脂、脂肪肝等多种功效。
3.作为传统名药，我国早在1500多年前的南北朝时期就开始了茯苓人工栽培的尝试。目前在湖北、安徽、云南、湖南、贵州等地均有大面积的栽培，但当前茯苓产业仍然存在很多的问题，限制了茯苓相关产业进一步健康、良性发展。一方面，茯苓菌种资源混乱，菌种退化，优良菌种缺乏，造成松木资源的浪费；另一方面，茯苓的栽培仍然使用传统大田栽培模式，具有严重的连作障碍，占用了大量的土地资源。建立茯苓的育种体系，选育优良菌株，选育适合不覆土栽培的菌株，是解决目前茯苓产业问题的关键。
4.同核菌株是杂交育种的基础，同时也是测序组装高质量基因组、研究等位基因、杂种优势、遗传连锁、重组热点等的关键材料，因此同核菌株的鉴定具有重要意义。对于存在锁状联合的真菌，可以简单地通过锁状联合的有无来鉴定同核菌株，不需要引入其他方法。对于不存在锁状联合的真菌，例如双孢蘑菇(agaricus bisporus(lange)sing.)，同核菌株的鉴定主要包括基于菌落形态、rapd(random amplified polymorphic dna)、issr(inter-simple sequence repeat)、同工酶标记等多种方法。
5.茯苓是一种没有锁状联合的真菌，当前基于菌落形态、菌丝长速和ssr(simple sequence repeats)分子标记等鉴定茯苓同核菌株的方法在推及到多个菌株中时表现出适用性差、适用范围窄的现象，因此，目前缺乏一种稳定性强、适用性广的茯苓同核菌株鉴定方法。
6.目前，缺乏稳定、高效的同核菌株鉴别方法已经成为茯苓育种和遗传学研究工作的瓶颈，因此，本领域亟需准确鉴定茯苓种群内不同菌株的同核菌株的方法。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种稳定性强、适用性广的茯苓同核、异核菌株的鉴定方法，为茯苓同核菌株杂交育种提供准确的菌株基础。
8.本发明目的是通过以下技术方案实现的。
9.一方面，本发明提供了一种基于rpb2序列杂合位点鉴定茯苓同核、异核菌株的方法，包括如下步骤：
10.提取待测茯苓菌株菌丝体dna；
11.对菌丝体dna的rpb2序列进行pcr扩增；
12.对扩增产物进行测序；以及
13.对测序峰图进行特异性杂合位点检查，从而确定待测茯苓菌株是同核菌株还是异核菌株。
14.在本发明的实施方案中，该特异性杂合位点为rpb2序列内tgtat*tctgt或tatctc*gtcggc中的*位点，其中，若*位点在测序峰图中为单峰，则待测茯苓菌株为同核菌株，若*位点在测序峰图中为双峰，则待测茯苓菌株为异核菌株。
15.另一方面，本发明提供了用于鉴定茯苓同核、异核菌株的试剂盒，包含用于扩增rpb2序列的引物。
16.与现有技术相比，本发明具有有益的技术效果。茯苓在rpb2基因上存在稳定的杂合c/t位点，由于rpb2基因在物种内的保守性，从而能够将本方法应用到整个茯苓物种群体中，体现了该方法的广泛适用性，同时本发明基于测序技术，能够得到精准的序列数据，通过对茯苓rpb2基因上存在c或t还是c/t来判断茯苓菌丝体为同核菌株还是异核菌株，该方法稳定且准确，与传统基于pcr的方法相比，避免了出现假阳/阴性结果，从而可以准确的判断茯苓整个群体中不同菌株的同核菌株，实现一种方法即可解决茯苓同核菌株鉴定困难的问题。
附图说明
17.图1为实施例2中的pcr产物琼脂糖凝胶电泳结果图。
18.图2为实施例2中两种rpb2序列同核菌株和异核菌株特异杂合位点峰图。
19.图3为实施例3中不同来源茯苓菌株rpb2序列杂合位点峰图。
具体实施方式
20.下面将结合具体实施方案对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
21.rpb2(the second largest rna polymerase subunit)基因负责编码rna聚合酶ii的第二个大亚基，是一种非常保守的基因，常与its(internal transcribed spacer)、lsu(ribosomal large subunit)等一起用于真菌物种的鉴定。在同一物种内rpb2序列差异极其微小，便于在物种群体内稳定扩增，但在很多物种中该片段表现为纯合，其单孢菌株后代不存在snp(single nucleotide polymorphism)位点，因而无法用于鉴定同核或单核菌株后代。相较于rpb2基因，很多基因在单孢菌株后代中存在snp，但在物种群体不同菌株间常出现序列保守性差，不能稳定扩增的情况。因此这种保守基因不存在杂合位点，存在杂合位点的基因不保守的情况导致目前极少使用于纯/杂合位点鉴别同核菌株。然而，茯苓在rpb2基因上存在一稳定的杂合c/t位点，同时满足了既存在保守性序列，能够实现稳定扩增，又存在杂合位点能够用于同核菌株的鉴定两个方面，为茯苓物种群体内同核菌株的鉴定提供了稳定性强，且使用范围广的方法。
22.因此，一方面，本发明提供了一种基于rpb2序列杂合位点鉴定茯苓同核、异核菌株
的方法，其包括以下步骤：
23.提取待测茯苓菌株菌丝体dna；
24.对所述菌丝体dna的rpb2序列进行pcr扩增；
25.对扩增产物进行测序；以及
26.对测序峰图进行特异性杂合位点检查，从而确定茯苓菌株是同核菌株还是异核菌株。
27.在本发明方法的实施方案中，用于pcr扩增的引物可以为简并引物rpb2-5f和rpb2-7cr：
28.rpb2-5f：5
’‑
gaygaymgwgatcayttygg-3’(seq id no:1)，rpb2-7cr：5
’‑
cccatrgcttgyttrcccat-3’(seq id no:2)，
29.其中y表示c或t，m表示a或c，w表示a或t，r表示a或g。
30.在本发明方法的实施方案中，pcr扩增的反应体系可以为：
[0031]2×
rapidtaq master mix 12.5μl；
[0032]
引物rpb2-5f(10μmol/l)1μl；
[0033]
引物rpb2-7cr(10μmol/l)1μl；
[0034]
ddh2o 8.5μl；
[0035]
dna模板：2μl。
[0036]
在本发明方法的实施方案中，pcr扩增的反应程序可以为：
[0037]
步骤1：95℃5min；
[0038]
步骤2：95℃60sec；
[0039]
步骤3：55℃120sec；
[0040]
步骤4：72℃90sec；
[0041]
步骤5：重复步骤2～4，35个循环；以及
[0042]
步骤6：72℃10min。
[0043]
在本发明方法的实施方案中，可以利用例如bioedit、snapgene等软件进行特异性杂合位点检查。
[0044]
在本发明方法的实施方案中，特异性杂合位点为rpb2序列内tgtat*tctgt或tatctc*gtcggc中的*位点，其中，若*位点在测序峰图中为单峰，即c或t单峰，则待测茯苓菌株为同核菌株，若*位点在测序峰图中为双峰，即c/t双峰，则待测茯苓菌株为异核菌株。
[0045]
另一方面，本发明提供了用于鉴定茯苓同核、异核菌株的试剂盒，其包含用于扩增rpb2序列的引物rpb2-5f和rpb2-7cr：
[0046]
rpb2-5f：5
’‑
gaygaymgwgatcayttygg-3’(seq id no:1)，
[0047]
rpb2-7cr：5
’‑
cccatrgcttgyttrcccat-3’(seq id no:2)，
[0048]
其中y表示c或t，m表示a或c，w表示a或t，r表示a或g。
[0049]
在第三方面，本发明还提供了序列rpb2-5f和rpb2-7cr在鉴定鉴定茯苓同核、异核菌株中的用途。
[0050]
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这
些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。
[0051]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0052]
实施例1.茯苓单孢菌株收集
[0053]
将茯苓菌株(表1所示的菌株775、776)转接至茯苓子实体诱导培养基(pda添加kh2po41 g/l,mgso4·
7h2o 0.5g/l,and vb1 10 mg/l，曾桂平，李忠，张文龙，赵致.2018.不同培养条件对茯苓产孢量的影响.2018,25(4):43-46.)中，黑暗环境下培养5-7d，菌丝长满平板后转置于400-500lx连续光照，25℃恒温培养箱环境下培养，至子实体形成后，采用孢子倒置弹射法，收集茯苓孢子制成孢子悬液，稀释至1
×
103个/ml后，吸取100μl均匀涂布于装有pda培养基中的90cm培养皿中。置于25℃黑暗恒温培养箱中培养，至4d后逐渐挑取萌发的单菌落于新的培养皿中，25℃培养备用。
[0054]
实施例2.茯苓同核菌株鉴定
[0055]
采用改良ctab法(doyle jj,and doyle jl.1987.a rapid dna isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.phytochemistry bulletin 19:11-15.)提取实施例1中挑取菌株的菌丝体dna，并采用引物rpb2-5f和rpb2-7cr(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行pcr扩增，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行sanger测序，测序引物为rpb2-5f，测序为单向，测序长度为一个反应。
[0056]
pcr扩增所用的rpb2-5f和rpb2-7cr为简并引物，引物序列如下：
[0057]
rpb2-5f：5
’‑
gaygaymgwgatcayttygg-3’(seq id no:1)，
[0058]
rpb2-7cr：5
’‑
cccatrgcttgyttrcccat-3’(seq id no:2)。
[0059]
pcr扩增反应体系如下：
[0060]2×
rapid taq master mix 12.5μl；
[0061]
引物rpb2-5f(10μmol/l)1μl；
[0062]
引物rpb2-7cr(10μmol/l)1μl；
[0063]
ddh2o 8.5μl；
[0064]
dna模板2μl。
[0065]
pcr扩增反应程序如下：
[0066]
步骤1：95℃5min；
[0067]
步骤2：95℃60sec；
[0068]
步骤3：55℃120sec；
[0069]
步骤4：72℃90sec；
[0070]
步骤5：重复步骤2～4，35个循环；
[0071]
步骤6：72℃10min。
[0072]
琼脂糖凝胶电泳检测条件为：将pcr产物及dna marker(2kbp，包括分子量为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp的核酸片段)点样于1％(质量体积比)的琼脂糖凝胶，150v电压下电泳10min，然后置于凝胶成像仪观察，结果如图1所示，扩增获得了单一且大小为1100bp左右的正确条带。
[0073]
sanger测序要求：
[0074]
所需测序引物为上游引物rpb2-5f(5
’‑
gaygaymgwgatcayttygg-3’(seq id no:1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，测序为单向测序，测序长度为一个反应。测序结果表明，rpb2的序列长度为1160-1180bp(包含引物序列),如seq id no:3所示。
[0075]
杂合位点分析：
[0076]
使用bioedit软件将测序结果峰图*.abi文件打开，在测序结果即seq id no:3的480bp左右(470-485bp)查找tgtat*tctgt或tatctc*gtcggc中的*位点，如图2所示，亲本776在tgtat*tctgt序列的*位点为双峰，即c/t双峰，这表示该位点上同时出现了c和t，因此亲本776为异核菌株，挑取的菌株776ss1727和776ss1761在该位点均为单峰，分别为t单峰和c单峰，因此776ss1727和776ss1761为同核菌株。同样，挑取的菌株776ss1523在该位点为双峰，即c/t双峰，因此776ss1523为异核菌株；亲本775在tatctc*gtcggc序列的*位点为双峰，即c/t双峰，因此亲本775为异核菌株；挑取的菌株775ss89和775ss105在该位点均为单峰，分别为t单峰和c单峰，因此为同核菌株，而776ss11在该位点为双峰，即c/t双峰，因此776ss11为异核菌株。本实施例中鉴定的同核菌株和异核菌株与其他生物学方法鉴定的结果一致，从而验证了本发明的可靠性。因此，上述结果表明该方法可以准确鉴定茯苓同核菌株和异核菌株。
[0077]
实施例3.茯苓不同来源菌株rpb2杂合位点分析
[0078]
对表1所示来源中国普通微生物菌种保藏中心、陕西西乡食用菌所和华中农业大学菌种实验中心等的其余16株(除实施例1、2中所用的菌株775和776)茯苓菌株rpb2序列特异性杂合位点进行观察，结果如图3所示，其中15株茯苓菌株均存在如实施例2中776菌株的杂合位点，一株(764)此处为纯合且临近碱基存在突变情况。进一步采用如实施例1所示的方法收集多个菌株(如表1中的菌株755、904、912)的同核菌株，对rpb2特异杂合位点进行检测，结果均符合我们提出的基于rpb2序列特异性杂合位点鉴定茯苓同核、异核菌株的方法，表明该鉴定方法能够准确鉴定茯苓同核菌株和异核菌株，且在茯苓群体中存在较为广泛的适用性。
[0079]
表1供试菌株及来源信息
[0080]