环状RNA-circEXOC6B在抑制前列腺癌转移中的应用

环状rna-circexoc6b在抑制前列腺癌转移中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及环状rna-circexoc6b在抑制前列腺癌转移中的应用。


背景技术：

2.前列腺癌(pca)是男性最常见的恶性肿瘤之一。在我国，随着社会经济水平和医疗卫生条件提高以及前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，psa)筛查的普及，前列腺癌发病率呈上升趋势，并且初发病年龄有所下降；同时，前列腺癌年龄标准化的死亡率从2000年到2011年一直呈上升趋势。2020年美国肿瘤协会预测新诊断前列腺癌191,930例，占男性肿瘤的21％，位于男性肿瘤发病率第一位；死亡33,330例，位于男性癌症死亡率第二位。前列腺癌发病机制复杂，早期局限性前列腺癌可通过根治性手术、放射性粒子植入或外放射达到治愈效果。但前列腺癌容易发生骨、脑转移，并且过程相对隐匿。前列腺癌一旦发生转移进入晚期阶段，治疗手段相对有限。目前针对晚期前列腺癌的治疗仍以去雄激素治疗为主，但这类患者最终会转变为去雄抵抗性前列腺癌，导致其生存时间大为缩短。目前，前列腺癌的发生、发展机制尤其是前列腺癌转移机制仍未明确。深入探讨前列腺癌的发病和转移机制、寻找有效的诊断、治疗靶点已经成为临床治疗的迫切需要，是目前临床和基础研究的重点。
3.circrna是一类由外显子或内含子反向剪接形成的闭合环状rna，广泛存在于人体细胞中，在不同物种中具有高度保守性，但在不同组织、不同发育阶段和不同疾病中又具有其特异性。越来越多的证据表明，circrna和mrna、lncrna一样，富含大量的小rna(microrna)结合位点，可作为microrna海绵，通过吸附microrna或与rna结合蛋白结合形成复合物，作为竞争性内源rna(cerna)发挥调控作用，调控下游靶基因的表达，进而参与调控包括癌症在内的人体各种疾病的发生和发展。有文献报道，circ_smarca5在pca中高度表达，可以促进pca的增殖和转移。另有文献报道，在pca中过表达的circ_hipk3不仅促进了pca细胞增殖和细胞周期转化，而且显著抑制了pca细胞的凋亡。
4.但目前未见环状rna-circexoc6b抑制前列腺癌转移的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供环状rna-circexoc6b的新用途。
6.第一方面，本发明提供了环状rna-circexoc6b或其增效剂在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
7.作为一个优选例，所述增效剂为生物大分子或小分子化合物。
8.更优选地，所述生物大分子为环状rna-circexoc6b的模拟核酸、过表达载体或由所述过表达载体转染和包装得到的病毒颗粒。
9.第二方面，本发明提供了环状rna-circexoc6b或其增效剂在制备抑制前列腺癌转移的药物中的应用。
10.作为一个优选例，所述增效剂为生物大分子或小分子化合物。
11.更优选地，所述生物大分子为环状rna-circexoc6b的模拟核酸、过表达载体或由所述过表达载体转染和包装得到的病毒颗粒。
12.第三方面，本发明提供了环状rna-circexoc6b或其增效剂在制备体外抑制前列腺癌细胞迁移或侵袭的试剂中的应用。
13.作为一个优选例，所述前列腺癌细胞为du145或pc-3细胞。
14.作为另一优选例，所述增效剂为生物大分子或小分子化合物。
15.更优选地，所述生物大分子为环状rna-circexoc6b的模拟核酸、过表达载体或由所述过表达载体转染和包装得到的病毒颗粒。
16.第四方面，本发明提供了一种筛选抑制前列腺癌转移的潜在物质的方法，所述方法包括以下步骤：
17.(1)用候选物质处理表达环状rna-circexoc6b的体系；
18.(2)检测所述体系中环状rna-circexoc6b的表达；若所述候选物质可提高环状rna-circexoc6b的表达，则表明该候选物质是需要的潜在物质，反之则表明该候选物质是非需要的潜在物质。
19.本文中，所述的“环状rna-circexoc6b的增效剂”包括了激动剂、上调剂、稳定剂等，是指任何可提高环状rna-circexoc6b的活性、提高环状rna-circexoc6b的稳定性、上调环状rna-circexoc6b的表达、增加环状rna-circexoc6b有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明。它们可以是化学小分子或生物大分子。所述生物大分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，蛋白水平的，也可以是上调环状rna-circexoc6b的病毒产品等，例如可以是环状rna-circexoc6b的模拟核酸，过表达载体，由所述过表达载体转染和包装得到的病毒颗粒等。所述“模拟核酸”是模拟生物体内源rna的分子，可运用载体表达或化学合成的方法合成，能增强内源性rna的含量。
20.根据本文，本领域技术人员可以根据本领域常规的生物药品制备方法制备得到治疗前列腺癌或抑制前列腺癌转移的以环状rna-circexoc6b或其增效剂为活性成分的药物组合物。所述“药物组合物”意指包含环状rna-circexoc6b或其增效剂与至少一种其它药用载体的组合物。“药用载体”是指本领域中通常接受用于将生物活性剂递送至动物(具体为哺乳动物)的介质，包括(即)佐剂、赋形剂或媒介物，诸如稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调控剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、增甜剂、矫味剂、芳香剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂，这取决于给药模式和剂型的性质。适合的给药途径包括但不限于，静脉注射、口服、直肠、气雾剂、非肠道给药、眼部给药、肺部给药、经皮给药、阴道给药、耳道给药、鼻腔给药及局部给药，所述非肠道给药包括肌肉注射、皮下注射、静脉注射、髓内注射、心室注射、腹膜内注射、淋巴管内注射及鼻内注射等。
21.本发明优点在于：
22.本发明首次发现circexoc6b在前列腺癌细胞和前列腺癌组织中低表达，进一步构建了过表达circexoc6b的稳转前列腺癌du145和pc-3细胞系，通过细胞transwell迁移实验和侵袭实验发现过表达circexoc6b可以显著的抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭。另外通过构建裸鼠肺转移瘤模型，我们发现将circexoc6b过表达的du145细胞经尾静脉注入裸鼠体内能显著抑制前列腺癌向裸鼠肺部的转移。因此，circexoc6b可作为前列腺癌新的治疗靶
标，本发明为前列腺癌药物的开发提供了参考。
附图说明
23.图1：pcr扩增产物及sanger测序结果。pcr扩增产物为单一条带，sanger测序验证其接头位点。
24.图2：circexoc6b在前列腺癌细胞中低表达。qpcr验证circexoc6b在细胞中的表达量，首先提取收集细胞的总rna，然后逆转录成cdna，再分别以β-actin、circexoc6b的特异引物进行实时qpcr，并使用δδct方法计算不同细胞系中circexoc6b表达量。**p值《0.01，***p值《0.001。
25.图3：circexoc6b在前列腺癌组织中低表达。qpcr验证circexoc6b在组织中的表达量，首先提取收集组织的总rna，然后逆转录成cdna，再分别以β-actin、circexoc6b的特异引物进行实时qpcr，并使用δδct方法计算组织中circexoc6b表达量。anp：前列腺癌旁正常组织，pca：前列腺癌组织。**p值《0.01。
26.图4：circexocb过表达质粒图。过表达质粒载体由novopro公司通过基因合成方法构建。
27.图5：在du 145和pc-3细胞中过表达circexoc6b。细胞转染共分为2组，分别是circexoc6b过表达质粒组、空质粒组(plvx-puro)即nc组。转染48h后收集du145和pc-3细胞，并利用qpcr分析过表达效率。oe circ:oe circexoc6b；***p值《0.001。
28.图6：过表达circexoc6b抑制前列腺癌细胞的迁移、侵袭。***p值《0.001。
29.图7：利用小干扰法敲低circexoc6b。si-circ:si circexoc6b；***p值《0.001。
30.图8：敲低circexoc6b促进前列腺癌细胞的迁移、侵袭。si-circ:si circexoc6b；**p值《0.01，***p值《0.001。
31.图9：过表达circexoc6b抑制裸鼠的肺肿瘤转移。***p值《0.001。
具体实施方式
32.下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
33.实施例1
34.一、方法
35.1、circexoc6b(hsa_circ_0009043)过表达质粒载体构建
36.1)过表达质粒构建
37.过表达质粒载体构建由novopro公司通过基因合成方法构建。质粒结构如图4所示，back circular frame circexoc6b的表达序列 front circular frame如seq id no:4所示，其中circexoc6b的表达序列为seq id no:4的第664-1053bp。
38.2)细胞转染
39.细胞转染共分为2组，分别是circexoc6b过表达质粒组、空质粒组(plvx-puro)即nc组。转染48h后收集du145和pc-3细胞。
40.3)设计circexoc6b引物并验证其特异性
41.首先提取收集细胞的总rna，然后逆转录成cdna。设计cirexoc6b的特异性引物。序列如下：forward:cctcaagtaagccactatcg(seq id no:1)；reverse:
agtatccgtcacttgattttgc(seq id no:2)。将pcr产物进行琼脂糖核酸电泳，验证其条带单一性，并送sanger测序，结果如图1所示。circbase中的环化位点序列如下：gagactgccatgaagcaaaatcaagtgacggatact(seq id no:3)。
42.2、慢病毒的包装
43.1)传代：将293t细胞以合适的比例用t75培养瓶放在co2培养箱中培养。在第2天，如果细胞融合度长到了70％至80％，则可准备进行转染。
44.2)换液：转染前2h给293t细胞换液，丢弃旧培养基，加入12ml新鲜培养基。
45.3)配制转染体系：准备一个无菌的1.5ml ep管，按下表配制转染体系并混匀，室温静置20min，然后用移液器均匀加到培养皿中，继续放在培养箱中培养。
46.表1转染体系
47.名称体积或质量opti-mem培养基1mllipod293体外dna转染试剂6μl辅助质粒14.875μg辅助质粒24.875μgcircexoc6b过表达质粒9.75μg
48.4)病毒收集：转染72h后，吸取293t细胞培养上清，加入到灭菌50ml离心管中，4℃条件下，4500
×
g离心5分钟，上清需经滤器过滤后再加入到新的灭菌离心管中。然后再将滤液加入到浓缩装置中，继续离心10分钟(4℃，4500
×
g)，丢弃下层的液体，再次离心20分钟(4℃，4500
×
g)，滤器上层液体则为需要的病毒浓缩液。
49.5)将病毒液分装，保存于-80℃冰箱以备后续使用。
50.3、慢病毒滴度测定
51.1)在第1天，将293t细胞常规胰酶消化和计数后，接种于96孔板(每孔8000个细胞)，放在37℃度培养箱中培养过夜。
52.2)在2天准备进行转染，细胞融合度最好达到80％左右。用含有10％fbs的dmem培养基对病毒液按照下面的梯度进行稀释：
53.1号病毒稀释液：10μl原病毒液 90μl含有10％fbs的dmem培养基；
54.2号病毒稀释液：10μl 1号稀释液 90μl含有10％fbs的dmem培养基；
55.3号病毒稀释液：10μl 2号稀释液 90μl含有10％fbs的dmem培养基；
56.4号病毒稀释液：10μl 3号稀释液 90μl含有10％fbs的dmem培养基；
57.5号病毒稀释液：10μl 4号稀释液 90μl含有10％fbs的dmem培养基；
58.6号病毒稀释液：10μl 5号稀释液 90μl含有10％fbs的dmem培养基。
59.3)丢弃原90μl旧培养基，加入90μl混匀过的慢病毒稀释液，继续放入37℃细胞培养箱中培养。
60.4)第3天，丢弃原含慢病毒的旧培养基，再加入100μl的含有10％fbs的dmem完全培养基。
61.5)第5天，在荧光显微镜下仔细观察96孔板中各孔携带绿色荧光的细胞数量，病毒滴度的计算方法为携带荧光的细胞数与相应的稀释倍数相乘。
62.6)慢病毒液滴度测定：
63.1号孔：1号病毒稀释液，含有10
×
10-3
ml慢病毒原液；
64.2号孔：2号病毒稀释液，含有10
×
10-4
ml慢病毒原液；
65.3号孔：3号病毒稀释液，含有10
×
10-5
ml慢病毒原液；
66.4号孔：4号病毒稀释液，含有10
×
10-6
ml慢病毒原液；
67.5号孔：5号病毒稀释液，含有10
×
10-7
ml慢病毒原液；
68.6号孔：6号病毒稀释液，含有10
×
10-8
ml慢病毒原液。
69.4、细胞铺板
70.将生长状态良好、融合度在80～90％左右的细胞取出，经过清洗、消化、离心和重悬传代后接种在六孔培养板上。保证细胞在24h后转染时密度达到50-60％左右，并且分布均匀，有利于提高慢病毒的转染效率。
71.5、稳转细胞株构建
72.1)前列腺癌细胞du145和pc-3提前一天接种于六孔板中，铺板密度约50％。
73.2)感染前，将慢病毒液从-80℃冰箱取出，在冰上融化后用新鲜完全培养基稀释成所需浓度。
74.3)丢弃旧的培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中。
75.4)同时加入polybrene液，其终浓度为8μg/ml，继续培养。
76.5)感染24h后，丢弃含慢病毒的培养基，更换为新鲜的完全培养基，并培养48h。
77.6)为了进行后续的细胞筛选，向每孔中加入嘌呤霉素(终浓度6μg/ml)。继续培养48～72h后，在荧光显微镜下观察每个孔的感染效率。待筛选到稳转细胞株后，提取rna，rt-qpcr检测circexoc6b表达情况。
78.6、细胞transwell迁移实验
79.transwell是一种用来研究细胞迁移和侵袭的实验技术，其材料主要为transwell小室。transwell小室的滤膜是聚碳酸酯膜，具有一定的通透性，孔径大小约为8.0μm，将transwell小室放入配套的24孔板中，则可分为上室和下室。可向上下室装入不同的液体，上室内的细胞能够透过聚碳酸酯膜进入下室，因此通常情况下计算下室内的细胞数目就可以间接反映培养细胞的迁移和侵袭能力。
80.1)细胞准备：取对数生长期的circexoc6b稳转细胞和nc细胞经过常规清洗、胰酶消化、离心、细胞计数。
81.2)transwell小室安放：将transwell小室放入提前准备好的配套的24孔板中。以du145细胞(circexoc6b稳转细胞和nc细胞)4万/孔，pc-3细胞(circexoc6b稳转细胞和nc细胞)8万/孔接种于上室，向上室内补充无血清培养基至100μl，然后向下室内加入含20％血清完全培养基600μl，注意避免产生气泡，置于37℃细胞培养箱分别孵育36h(du 145细胞)，48h(pc-3细胞)。
82.3)固定：晾干后将小室放入4％多聚甲醛中浸泡20min。
83.4)染色：经pbs溶液洗3次晾干后再用结晶紫染料染色30min，注意避光。
84.5)清洗：继续用pbs溶液清洗，连续3次。
85.6)擦除：取出transwell小室，用医用棉签轻轻擦拭以去除滤膜上层没有迁移的细胞。再用pbs溶液清洗3遍，注意避免损伤细胞。
86.7)结果统计：用倒置显微镜(
×
200倍)进行拍照，随机选择3个视野计数。计数后求
各个视野的平均值进行统计分析并作图。
87.7、细胞transwell侵袭实验
88.细胞transwell侵袭实验的操作步骤与transwell迁移试验的步骤相类似，其不同点在于向上室内加入细胞之前需提前加入matrigel胶(一种有生物活性的材料，可用于体外实验，研究细胞的侵袭能力，4℃时为液态，37℃时为凝胶态)。操作方法如下：
89.1)从-20℃冰箱中将matrigel胶取出，放置在冰上解冻。用预冷的无血清培养液稀释matrigel胶，使其终浓度变为250μg/ml，混匀。向transwel小室的上层加入100μlmatrigel胶，在37℃培养箱中放置4h或过夜，待其成为凝胶状后方可取出使用。
90.2)其余步骤与上述transwell迁移实验相同。
91.circexoc6b敲降后的transwell迁移与侵袭实验步骤与上述一致。
92.8、裸鼠肺转移瘤模型
93.1)购买4周龄balb/c雌性裸鼠。
94.2)给每只裸鼠打耳标，标记清楚后随机分组，9只/组。
95.3)细胞准备：取对数生长期的过表达circexoc6b的du145稳转细胞和携带空质粒的du145稳转细胞，常规消化离心后，用无血清培养基进行重悬细胞，显微镜下计数，调整细胞浓度至2
×
106个/ml。
96.4)用一次性无菌注射器，采用尾静脉注射的方法，每只小鼠注射细胞悬液100μl。
97.5)尾静脉种瘤50天后，给裸鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，处死后将肺部标本取出，并按分组拍照。4％多聚甲醛固定，室温保存。
98.9、统计学分析方法
99.本研究中收集的所有数据应用spss 22.0和prims 8软件进行统计分析。统计结果均用平均值
±
标准误表示。两组数据之间的差异比较根据数据分布采用student's t检验或者mann-whitney u检验。相关性分析采用皮尔逊法(pearson)或是斯皮尔曼法(spearman)。当p值＜0.05时认为差异有统计学意义。
100.二、结果与分析
101.1、circexoc6b在前列腺癌细胞系中的表达及稳转细胞系构建
102.为了研究circexoc6b在前列腺癌中的功能，我们在人正常前列腺上皮永生化细胞repe-1和前列腺癌癌细胞系2rv1、pc-3、du145中，以及前列腺癌组织和癌旁正常组织检测其表达。实时定量pcr结果表明circexoc6b在前列腺癌细胞系(2rv1、pc-3、du145)以及前列腺癌组织中显著下调(图2、图3)。通过使用过表达circexoc6b的慢病毒，我们选取circexoc6b表达差异显著的du145和pc-3细胞，构建了稳定的circex0c6b过表达细胞系和阴性对照细胞系(含空质粒)。通过实时定量pcr证实了circexoc6b的过表达效率(图5)。
103.2、circexoc6b抑制人前列腺癌细胞迁移能力
104.为了研究circexoc6b对于前列腺癌细胞迁移能力的影响，我们做了transwell肿瘤迁移实验。结果显示，过表达circexoc6b显著抑制了前列腺癌细胞du145和pc-3的细胞迁移能力，差异具有统计学意义(图6)。
105.3、circexoc6b抑制前列腺癌细胞侵袭能力
106.我们通过transwell实验进一步观察过表达circexoc6b对于前列腺癌细胞侵袭能力的影响。实验结果表明，过表达circexoc6b的du145和pc-3细胞，穿过matrigel胶和
transwell小室的滤膜的数量均较对照组细胞明显减少，差异具有统计学意义(图6)。
107.4、敲降circexoc6b促进前列腺癌细胞的迁移、侵袭
108.通过transwell实验表明，敲降circexoc6b(图7)显著促进du 145和pc-3细胞的迁移、侵袭，差异具有统计学意义(图8)。
109.5、circexoc6b能在体内抑制前列腺癌细胞的肺转移
110.为了探讨circexoc6b在体内对前列腺癌转移的影响，我们将circexoc6b过表达的du145细胞和阴性对照的du145细胞分别经尾静脉注入裸鼠体内。裸鼠均为4周龄，体重、生活习性、健康状况无明显不同。肿瘤细胞接种后第50天处死小鼠，取出肺组织。并对circexoc6b过表达组和阴性对照组分组拍照。统计裸鼠肺表面的肿瘤转移结节，结果显示circexoc6b过表达组肺表面肿瘤转移结节数目显著低于对照组，差异具有统计学意义。裸鼠转移瘤实验结果表明，过表达circexoc6b可在体内抑制前列腺癌细胞转移(图9)。
111.三、讨论
112.前列腺癌是一种男性高发的恶性肿瘤。由于其高度的异质性，前列腺癌的发病机理目前仍未明确。circrnas被证明在多种癌症中都起到重要的调节作用。迄今为止，前列腺癌中circrna的表达谱和潜在功能仍未研究清楚。为了研究前列腺癌中circrna表达谱及其在前列腺癌发生发展中的作用，寻找新的诊断标志物和治疗靶点，我们选取了5例前列腺癌患者，采用了微阵列(microarray)芯片技术同时检测前列腺癌组织和癌旁正常组织中差异表达的circrna和mrna分子。microarray芯片可同时检测成千上万个基因的表达，是基因功能分析的最重要高通量技术之一。随着microarray技术在临床的广泛应用，microarray高通量筛选已经成为多种疾病研究生物标记物和治疗靶标重要研究手段。我们将circrna的microarray和mrna的microarray芯片结合起来研究前列腺癌。通过对两种rna的综合分析，在整体水平上探讨前列腺癌中差异表达的circrnas与mrnas的相互调节作用。通过芯片筛查，我们鉴定出显著差异表达的95种circrna和785种mrna(变化倍数≥2倍且p值＜0.05)。go分析表明差异表达的mrna在染色体分离、有丝分裂的核分裂、细胞外基质、细胞周期过程等go基因集上富集，这些都与前列腺癌的发病机制密切相关。我们通过实时定量pcr验证了circexoc6b在前列腺癌组织中显著下调。环状rna分子circexoc6b是来源于exoc6b基因的第三、四、五、六外显子的环状转录产物，circexoc6b序列全长390bp。exoc6b基因位于人类第2号染色体，编码exoc6b蛋白。本发明首次发现circexoc6b在前列腺癌组织中低表达。本发明使用慢病毒包装质粒并转染前列腺癌细胞du145和pc-3细胞，构建了过表达circexoc6b的稳转细胞和阴性对照细胞。通过细胞功能学实验，我们发现过表达circexoc6b可以显著的抑制前列腺癌的迁移、侵袭能力，表明circexoc6b在前列腺癌的发生发展过程中起到重要的调节作用。同时，裸鼠转移瘤实验表明circexoc6b过表达显著抑制了前列腺癌细胞在动物体内的转移，进一步证明了circexoc6b对于前列腺癌细胞的抑制作用。通过上述体内和体外的功能学实验证实circexoc6b对于前列腺癌的迁移、侵袭的生物学行为具有显著的抑制作用，有望为前列腺癌患者提供新的治疗靶标和方向。
113.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。