一种同时检测饲料中九种有机酸含量的方法与流程

1.本发明涉及饲料检测技术领域，尤其是涉及一种同时检测饲料中九种有机酸含量的方法。


背景技术：

2.酸度调节剂也称ph调节剂，是饲料中常见的一种无残留、无抗药性、无毒害作用的环保型添加剂，包括酸化剂、碱剂及盐类，它可调节饲料在消化道中的ph，为动物提供最适消化道环境。其中酸化剂可分为单一酸化剂和复合酸化剂，甲酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙二酸都属于单一酸化剂，而复合酸化剂就是指将两种或以上的单一酸化剂按照一定的比例复合而成。复合酸化剂中各成分协同作用，能有效克服单一酸化剂的不足，扩大酸化剂的酸度阈值和抑菌系区，且复合酸化剂酸性相对稳定，不会造成动物胃肠道酸度时高时低的情况。但复合酸化剂成分复杂，难以准确评估各成分含量。因此，为保证饲料成分安全，开发饲料添加剂中酸度调节剂的检测方法至关重要。
3.目前，常用的饲料中酸化剂的检测方法主要有：电位滴定法、毛细管电泳法、气相色谱法、液相色谱法等。液相色谱法因其特异性强、准确度高、可用于多种有机酸的同时分离检测，成为了饲料添加剂中有机酸最常用的检测方法。例如，在中国专利文献上公开的“一种同时测定饲用酸化剂中多种有机酸含量的方法”，其公告号cn101650347b，采用液相色谱法同时测定饲用酸化剂中甲酸、乳酸、柠檬酸、富马酸和丙酸五种有机酸含量。
4.但现有的液相色谱法对饲料中的有机酸进行检测时，当有机酸种类较多时，难以有效分离，色谱图有较严重的峰重叠现象，一次可同时检测出的有机酸种类仍然较少，不利于对饲料中复合酸化剂的成分进行有效检测和分析。


技术实现要素：

5.本发明是为了克服现有的液相色谱法一次可同时检测出的饲料中的有机酸种类较少，不利于对饲料中复合酸化剂的成分进行有效检测和分析的问题，提供一种同时检测饲料中九种有机酸含量的方法，通过对检测条件的优化，可同时测定饲料中的九种有机酸含量，大大提升了检测效率。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种同时检测饲料中九种有机酸含量的方法，包括如下步骤：(1)对饲料样品进行预处理得到待测液；(2)配制九种有机酸的标准溶液；九种有机酸为：草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸；(3)用高效液相色谱仪对标准溶液进行检测，得到标准曲线；然后对待测液进行检测，通过外标法计算待测液中的九种有机酸的含量；检测时采用的流动相由体积比为5～6:95～94的甲醇和质量浓度为0.04～0.06％的磷酸水溶液组成。
7.本发明采用高效液相色谱法测定饲料中的有机酸含量，通过对流动相的组分及用
量进行选择和优化，可以实现对草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸九种有机酸的有效分离，从而能够同时检测饲料中的九种有机酸，大大提升了检测效率；同时，本发明中的方法具有较高的精密度和良好的重现性，测定结果准确度高，有利于对饲料中复合酸化剂的成分及含量进行有效检测和分析。
8.作为优选，步骤(1)中的预处理方法为：将称取好的饲料样品置于离心管中，加入水摇匀后超声提取，然后离心分离，转移上清液后向残渣中加水再提取两次，合并三次提取得到的上清液并定容，得到待测液。
9.作为优选，饲料样品与三次提取时加入的水的添加量之比为0.1g:35～45ml:10～20ml:10～20ml；饲料样品与待测液的质量体积比为0.1g:100～150ml。
10.作为优选，超声提取时间10～15min；离心分离时的转速2000～4000r/min，离心时间5～10min。
11.作为优选，步骤(2)所述的标准溶液中九种有机酸的浓度范围为20～200μg/ml。
12.作为优选，步骤(3)中的检测条件为：柱温25～35℃；流速0.75～0.85ml/min；进样量10.0～10.2μl；检测波长214nm。
13.作为优选，步骤(3)中使用的色谱柱内径为4.5～5mm，长度200～250mm，固定相为季铵基和氨基改性硅胶；所述季铵基和氨基改性硅胶的制备方法为：a)将n,n-二甲基苄胺加入无水乙醇中，搅拌均匀后加热至75～85℃，搅拌状态下向溶液中滴加γ-氯丙基三甲氧基硅烷，75～85℃回流反应36～48h后得到硅烷改性季铵盐；b)将硅胶颗粒用2～4mol/l的盐酸溶液回流6～10h，过滤、洗涤、干燥后得到活化后的硅胶颗粒；c)将活化后的硅胶颗粒分散在干燥的甲苯中，然后加入硅烷改性季铵盐及γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀后氮气保护下回流反应24～36h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵基和环氧基改性硅胶；d)将季铵盐和环氧基改性硅胶分散在无水乙醇中，然后加入季戊四胺，氮气保护下搅拌反应60～72h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到所述季铵基和氨基改性硅胶。
14.本发明对硅胶颗粒的改性过程中，先通过步骤a)，利用叔胺化合物n,n-二甲基苄胺与γ-氯丙基三甲氧基硅烷的季铵化反应，得到硅烷改性季铵盐；然后再通过步骤c)，通过硅烷与硅胶颗粒表面羟基的反应，将硅烷改性季铵盐和γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷键合在硅胶颗粒表面，从而在硅胶颗粒表面修饰季铵基及环氧基；最后通过步骤d)，利用季戊四胺中的氨基与环氧基的开环反应，将季戊四胺键合在硅胶颗粒表面，得到季铵基和氨基改性硅胶。
15.本发明在硅胶表面修饰季铵基和氨基作为固定相，季铵基和氨基的修饰可以提升固定相的亲水性，并且在酸性条件下，带正电的季铵基和氨基可以与带负电的有机酸之间作用，提高了水溶性有机酸的保留。同时，本发明通过在硅烷改性季铵盐分子链中引入苯环，对固定相的亲疏水性能进行调控；并通过对与有机酸作用能力不同的季铵基和氨基比例进行调控，提升了对九种有机酸的分离性能，从而可实现对饲料中的九种有机酸的同时检测。
16.作为优选，步骤a)中n,n-二甲基苄胺与γ-氯丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为1:1～
1.2。
17.作为优选，步骤c)中硅胶颗粒、硅烷改性季铵盐、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的添加量之比为1g:0.5～0.7ml:0.3～0.5ml。
18.作为优选，步骤d)中季铵盐和环氧基改性硅胶与季戊四胺的质量比为1:0.2～0.3。
19.因此，本发明具有如下有益效果：通过对流动相及固定相的优化，可以实现对草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸九种有机酸的有效分离，从而能够同时检测饲料中的九种有机酸，大大提升了检测效率。
附图说明
20.图1是实施例1中九种有机酸的线性回归曲线；图2是实施例1中各浓度梯度的混合标准工作液的色谱图；图3是实施例1中待测液的色谱图；图4是对比例1中混合标准工作液的色谱图；图5是对比例2中混合标准工作液的色谱图；图6是对比例3中混合标准工作液的色谱图；其中，a)草酸；b)酒石酸；c)苹果酸；d)乙酸；e)乳酸；f)马来酸；g)柠檬酸；h)富马酸；i)琥珀酸。
具体实施方式
21.下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
22.在本发明中，若非特指，所有原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
23.实施例1：一种同时检测饲料中九种有机酸含量的方法，包括如下步骤：(1)分别称取四种青贮饲料样品0.1g(精确至0.0001g)，分别置于50ml离心管中，加入40ml水，摇匀30s，超声提取10min，3000r/min离心分离5min，转移上清液至100ml容量瓶中，向残渣中加15ml水再提取两次，合并三次提取得到的上清液，用水定容至刻度，得到四份待测液。
24.(2)分别配制九种有机酸的标准储备液，各标准储备液的浓度为：草酸标准储备液1.0mg/ml，酒石酸标准储备液1.0mg/ml，苹果酸标准储备液2.0mg/ml，乙酸标准储备液2.0mg/ml，乳酸标准储备液2.0mg/ml，马来酸标准储备液2.0mg/ml，柠檬酸标准储备液1.0mg/ml，富马酸标准储备液2.0mg/ml，琥珀酸标准储备液2.0mg/ml；分别取草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸标准储备液各10ml于100ml容量瓶中定容至刻度，混匀，配置成混合标准储备液；分别移取0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、7.50ml、10.00ml混合标准储备液于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，作为混合标准工作液，用高效液相色谱仪(agilent 1260)对混合标准工作液进行测定，制作标准曲线，结果如图1、图2和表1中所示；检测条件为：
色谱柱：内径4.6mm，长度250mm，固定相：季铵盐和氨基改性硅胶；流动相：体积比为6:94的甲醇和0.05wt％的磷酸水溶液；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；进样量：10.0μl；检测波长：214nm。
25.其中，季铵盐和氨基改性硅胶的制备方法为：a)将n,n-二甲基苄胺加入无水乙醇中，搅拌均匀后加热至80℃，搅拌状态下向溶液中滴加γ-氯丙基三甲氧基硅烷，n,n-二甲基苄胺与γ-氯丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为1:1.1，80℃回流反应40h后得到硅烷改性季铵盐；b)将球形硅胶颗粒(粒径5μm，孔径10nm，比表面积320m2/g，富士硅化工有限公司)用3mol/l的盐酸溶液回流8h，过滤、洗涤、干燥后得到活化后的硅胶颗粒；c)将活化后的硅胶颗粒分散在干燥的甲苯中，然后加入硅烷改性季铵盐及γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，硅胶颗粒、硅烷改性季铵盐、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的添加量之比为1g:0.6ml:0.4ml；搅拌均匀后氮气保护下回流反应30h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵盐和环氧基改性硅胶；d)将季铵盐和环氧基改性硅胶分散在无水乙醇中，然后加入季戊四胺，季铵盐和环氧基改性硅胶与季戊四胺的质量比为1:0.25；氮气保护下搅拌反应65h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵盐和氨基改性硅胶。
26.采用匀浆法将上述季铵盐和氨基改性硅胶装填在不锈钢色谱柱(4.6mm*250mm)中：将3.2g季铵盐和氨基改性硅胶分散在30ml 1,4-二氧六环中，超声分散3min得到匀浆液，以无水甲醇为顶替液，在40mpa的压力下填充至不锈钢色谱柱中，即得色谱柱。
27.表1：九种有机酸的标准曲线。序号标准物质名称回归方程相关系数(r2)检出限(g/kg)1草酸y＝4.15080x 1.748160.996070.252酒石酸y＝0.853627x 1.426650.998342.53苹果酸y＝0.437343x-0.6059560.999035.04乙酸y＝0.301178x-0.5951050.999225.05乳酸y＝0.274831x-0.6388940.999155.06马来酸y＝54.52267x-0.9506800.999150.057柠檬酸y＝0.575208x-0.9423430.998972.58富马酸y＝126.66368x-1.925160.999090.059琥珀酸y＝0.286455x-0.3822750.998885.0
28.(3)在相同的检测条件下采用高效液相色谱仪对待测液进行检测，通过外标法计算待测液中的九种有机酸的含量，结果如图3中所示，从图3中可以看出，采用本发明中的方法，可有效对饲料样品中的九种有机酸进行检测。
29.对待测液进行加标回收测试，通过加标回收率(gb/t 27404-2008)对方法的准确度进行评价，结果如表2中所示。
30.表2：加标回收测试结果。
31.从表2中可以看出，本发明中的方法具有较高的准确度。
32.实施例2：一种同时检测饲料中九种有机酸含量的方法，包括如下步骤：(1)称取青贮饲料样品0.1g(精确至0.0001g)，置于50ml离心管中，加入35ml水，摇匀30s，超声提取15min，2000r/min离心分离10min，转移上清液至100ml容量瓶中，向残渣中加20ml水再提取两次，合并三次提取得到的上清液，用水定容至刻度，得到待测液。
33.(2)分别配制九种有机酸的标准储备液，各标准储备液的浓度为：草酸标准储备液1.0mg/ml，酒石酸标准储备液1.0mg/ml，苹果酸标准储备液2.0mg/ml，乙酸标准储备液2.0mg/ml，乳酸标准储备液2.0mg/ml，马来酸标准储备液2.0mg/ml，柠檬酸标准储备液1.0mg/ml，富马酸标准储备液2.0mg/ml，琥珀酸标准储备液2.0mg/ml；分别取草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸标准储备液各10ml于100ml容量瓶中定容至刻度，混匀，配置成混合标准储备液；分别移取0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、7.50ml、10.00ml混合标准储备液于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，作为混合标准工作液，用高效液相色谱仪(agilent 1260)对混合标准工作液进行测定，制作标准曲线；检测条件为：色谱柱：内径4.6mm，长度250mm，固定相：季铵盐和氨基改性硅胶；流动相：体积比为5:95的甲醇和0.06wt％的磷酸水溶液；柱温：25℃；流速：0.75ml/min；进样量：10.0μl；检测波长：214nm。
34.其中，季铵盐和氨基改性硅胶的制备方法为：a)将n,n-二甲基苄胺加入无水乙醇中，搅拌均匀后加热至75℃，搅拌状态下向溶液中滴加γ-氯丙基三甲氧基硅烷，n,n-二甲基苄胺与γ-氯丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为1:1，75℃回流反应48h后得到硅烷改性季铵盐；b)将球形硅胶颗粒(粒径5μm，孔径10nm，比表面积320m2/g，富士硅化工有限公司)用2mol/l的盐酸溶液回流10h，过滤、洗涤、干燥后得到活化后的硅胶颗粒；
c)将活化后的硅胶颗粒分散在干燥的甲苯中，然后加入硅烷改性季铵盐及γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，硅胶颗粒、硅烷改性季铵盐、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的添加量之比为1g:0.5ml:0.3ml；搅拌均匀后氮气保护下回流反应24h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵盐和环氧基改性硅胶；d)将季铵盐和环氧基改性硅胶分散在无水乙醇中，然后加入季戊四胺，季铵盐和环氧基改性硅胶与季戊四胺的质量比为1:0.2；氮气保护下搅拌反应60h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵盐和氨基改性硅胶。
35.采用匀浆法将上述季铵盐和氨基改性硅胶装填在不锈钢色谱柱(4.6mm*250mm)中：将3.2g季铵盐和氨基改性硅胶分散在30ml 1,4-二氧六环中，超声分散3min得到匀浆液，以无水甲醇为顶替液，在40mpa的压力下填充至不锈钢色谱柱中，即得色谱柱。
36.(3)在相同的检测条件下采用高效液相色谱仪对待测液进行检测，通过外标法计算待测液中的九种有机酸的含量。
37.实施例3：一种同时检测饲料中九种有机酸含量的方法，包括如下步骤：(1)称取青贮饲料样品0.1g(精确至0.0001g)，置于50ml离心管中，加入45ml水，摇匀30s，超声提取10min，4000r/min离心分离5min，转移上清液至100ml容量瓶中，向残渣中加10ml水再提取两次，合并三次提取得到的上清液，用水定容至刻度，得到待测液。
38.(2)分别配制九种有机酸的标准储备液，各标准储备液的浓度为：草酸标准储备液1.0mg/ml，酒石酸标准储备液1.0mg/ml，苹果酸标准储备液2.0mg/ml，乙酸标准储备液2.0mg/ml，乳酸标准储备液2.0mg/ml，马来酸标准储备液2.0mg/ml，柠檬酸标准储备液1.0mg/ml，富马酸标准储备液2.0mg/ml，琥珀酸标准储备液2.0mg/ml；分别取草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸标准储备液各10ml于100ml容量瓶中定容至刻度，混匀，配置成混合标准储备液；分别移取0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、7.50ml、10.00ml混合标准储备液于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，作为混合标准工作液，用高效液相色谱仪(agilent 1260)对混合标准工作液进行测定，制作标准曲线；检测条件为：色谱柱：内径4.6mm，长度250mm，固定相：季铵盐和氨基改性硅胶；流动相：体积比为6:94的甲醇和0.04wt％的磷酸水溶液；柱温：35℃；流速：0.85ml/min；进样量：10.0μl；检测波长：214nm。
39.其中，季铵盐和氨基改性硅胶的制备方法为：a)将n,n-二甲基苄胺加入无水乙醇中，搅拌均匀后加热至85℃，搅拌状态下向溶液中滴加γ-氯丙基三甲氧基硅烷，n,n-二甲基苄胺与γ-氯丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为1:1.2，85℃回流反应36h后得到硅烷改性季铵盐；b)将球形硅胶颗粒(粒径5μm，孔径10nm，比表面积320m2/g，富士硅化工有限公司)用4mol/l的盐酸溶液回流6h，过滤、洗涤、干燥后得到活化后的硅胶颗粒；c)将活化后的硅胶颗粒分散在干燥的甲苯中，然后加入硅烷改性季铵盐及γ-缩
水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，硅胶颗粒、硅烷改性季铵盐、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的添加量之比为1g:0.7ml:0.5ml；搅拌均匀后氮气保护下回流反应36h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵盐和环氧基改性硅胶；d)将季铵盐和环氧基改性硅胶分散在无水乙醇中，然后加入季戊四胺，季铵盐和环氧基改性硅胶与季戊四胺的质量比为1:0.3；氮气保护下搅拌反应72h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵盐和氨基改性硅胶。
40.采用匀浆法将上述季铵盐和氨基改性硅胶装填在不锈钢色谱柱(4.6mm*250mm)中：将3.2g季铵盐和氨基改性硅胶分散在30ml 1,4-二氧六环中，超声分散3min得到匀浆液，以无水甲醇为顶替液，在40mpa的压力下填充至不锈钢色谱柱中，即得色谱柱。
41.(3)在相同的检测条件下采用高效液相色谱仪对待测液进行检测，通过外标法计算待测液中的九种有机酸的含量。
42.对比例1(不对固定相进行改性)：对比例1中色谱柱的固定相采用未经改性的球形硅胶颗粒，其余均与实施例1中相同。对比例1的混合标准工作液的色谱图如图4所示。
43.对比例2(只在固定相上修饰季铵基)：对比例2中色谱柱的固定相采用季铵盐改性硅胶，其制备方法为：a)将n,n-二甲基苄胺加入无水乙醇中，搅拌均匀后加热至80℃，搅拌状态下向溶液中滴加γ-氯丙基三甲氧基硅烷，n,n-二甲基苄胺与γ-氯丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为1:1.1，80℃回流反应40h后得到硅烷改性季铵盐；b)将球形硅胶颗粒(粒径5μm，孔径10nm，比表面积320m2/g，富士硅化工有限公司)用3mol/l的盐酸溶液回流8h，过滤、洗涤、干燥后得到活化后的硅胶颗粒；c)将活化后的硅胶颗粒分散在干燥的甲苯中，然后加入硅烷改性季铵盐，硅胶颗粒与硅烷改性季铵盐的添加量之比为1g:1ml；搅拌均匀后氮气保护下回流反应30h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵盐改性硅胶。
44.其余均与实施例1中相同。对比例2的混合标准工作液的色谱图如图5所示。
45.对比例3(只在固定相上修饰氨基)：对比例3中色谱柱的固定相采用氨基改性硅胶，其制备方法为：其中，季铵盐和氨基改性硅胶的制备方法为：a)将球形硅胶颗粒(粒径5μm，孔径10nm，比表面积320m2/g，富士硅化工有限公司)用3mol/l的盐酸溶液回流8h，过滤、洗涤、干燥后得到活化后的硅胶颗粒；b)将活化后的硅胶颗粒分散在干燥的甲苯中，然后加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，硅胶颗粒与γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的添加量之比为1g:1ml；搅拌均匀后氮气保护下回流反应30h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到环氧基改性硅胶；c)将环氧基改性硅胶分散在无水乙醇中，然后加入季戊四胺，环氧基改性硅胶与季戊四胺的质量比为1:0.25；氮气保护下搅拌反应65h，将产物过滤、洗涤、干燥后得到季铵盐和氨基改性硅胶。
46.其余均与实施例1中相同。对比例3的混合标准工作液的色谱图如图6所示。
47.从上述结果中可以看出，实施例1～3中采用本发明中的方法可有效对饲料中的九种有机酸进行分离，测量精密度和准确度高。对比例1中不对固定相进行改性，九种有机酸
的保留时间缩短，草酸和酒石酸无法有效分离；对比例2中只用季铵基对固定相进行改性，九种有机酸间的分离效果不佳；对比例3中只用氨基对固定相进行改性，也同样都会影响九种有机酸的分离性能，难以实现九种有机酸的同时检测。