4,6,7-三取代1,2-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶/嘧啶-3-酮衍生物及用途的制作方法

1.本发明属于医药技术领域。具体地，本发明特别涉及一种4,6,7-三取代的1,2-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶/嘧啶-3-酮衍生物及其制备方法和作为btk抑制剂的应用，以及由其制备的药物组合物。


背景技术：

[0002]
btk激酶是tec激酶家族中的一种非受体络氨酸激酶，是bcr信号通路的关键调节因子，对于b细胞成熟、增殖、存活具有重要的作用。在多种b细胞淋巴瘤中btk都有过度表达，是目前tec激酶家族中唯一经过临床验证的有效的药物开发的靶点。抑制btk能够抑制一系列b细胞淋巴瘤的增殖。
[0003]
b细胞抗原受体(bcr)信号通道的活化对诱发和维持b细胞恶性肿瘤及自免疫疾病有重要作用。bruton's酪氨酸激酶(btk)在造血细胞bcr信号通道中起着关键作用，是淋巴瘤新疗法研究中非常良好的靶点。btk抑制剂作用于bcr通路,抑制btk自磷酸化，btk's生理底物plcγ磷酸化和下游激酶erk的磷酸化。
[0004]
btk抑制剂作用于慢性淋巴细胞白血病(cll)细胞，诱导细胞毒性，抑制cll细胞增殖能力。抑制bcr激活的原代b细胞增殖，且抑制原代单核细胞中tnfα,il-1β和il-6等分泌。btk抑制剂作用于胶原诱导的关节炎模型，通过抑制b细胞活性，显著降低足肿胀和关节发炎等临床关节炎症状。
[0005]
目前仅有唯一的btk抑制剂ibrutinib获批上市，因此有必要开发更多活性更好，更加安全有效的btk抑制剂。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一类结构新颖的可作为btk抑制剂的化合物。
[0007]
本发明第一方面提供了一种式(i)所示的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或前药：
[0008][0009]
式中，x为一个键、nr
a1
、s、so、so2或o；其中r
a1
为氢、羟基或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；
[0010]
a为c
6-10
芳基(优选苯基)、4至7元饱和或不饱和单杂环、5至6元单环杂芳基环、8至
10元双环杂芳基环；
[0011]
z为n或cr
b1
；其中r
b1
为氢、卤素(优选氟、氯、溴)、氰基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)或c
3-8
环烷氧基(优选为c
3-6
环烷氧基)；
[0012]
r5、r6各自独立地为氢、卤素(优选氟、氯、溴)、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)或c
3-8
环烷氧基(优选为c
3-6
环烷氧基)；
[0013]
n为0或1；其中
[0014]
(i)n为0时，r1、r3各自独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；r2与r4连接形成4到7元饱和或不饱和单杂环；
[0015]
(ii)n为0时，r2、r4各自独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；r1与r3连接形成4到7元饱和或不饱和单杂环；
[0016]
(iii)n为0时，r2为氢、卤素、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；r3与r1、r4连接形成桥杂环；或r3为氢、卤素、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；r2与r1、r4连接形成桥杂环；
[0017]
(iv)n为1时，r2、r3各自独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；ra与r1以及rb与r4连接，共同形成螺杂环；
[0018]
(v)n为1时，r2、r3、rb各自独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；ra分别与r1、r4连接，共同形成桥杂环；
[0019]
(vi)n为1时，r1、r3、ra、rb各自独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；r2、r4连接形成5到7元饱和或不饱和单杂环；
[0020]
所述烷基、环烷基、烷氧基、芳基、饱和或不饱和单杂环、单环杂芳基环、双环杂芳基环、螺杂环、桥杂环为未取代的或被1、2或3个选自下组的取代基所取代：羟甲基、羟乙基、羟基、羧基、卤素、-o(ch2)
p
oc
1-8
烷基、-o(ch2)
p
oh、-(ch2)
p
oc
1-8
烷基、4至6元饱和单杂环、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、卤代c
3-8
环烷基(优选为卤代c
3-6
环烷基)、羟基取代的c
1-8
烷基(优选为羟基取代的c
1-6
烷基，更优选为羟基取代的c
1-3
烷基)、nr
a0rb0
、-c(o)oc
1-6
烷基、乙酰基、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷氧基(优选为卤代c
1-6
烷氧基，更优选为卤代c
1-3
烷氧基)、-so2c
1-8
烷基(优选为-so2c
1-6
烷基，更优选为-so2c
1-3
烷基)、c
6-10
芳基(优选苯基)、5至6元单环杂芳基或-y-l；其中y为(ch2)q或c(o)；l为4至6元饱和单杂环或5至6元单环杂芳基环；p、q各自独立地为1、2或3；r
a0
、r
b0
各自独立地为氢、乙酰基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)。
[0021]
在另一优选例中，取代基中的4至6元饱和单杂环为未取代的或被1、2或3个选自下组的基团取代：卤素、羟基、c
1-6
烷基、o＝、nr
a0rb0
、羟甲基、羟乙基、羧基、-c(o)oc
1-6
烷基、乙酰基、卤代c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、c
3-6
环烷基、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、
四氢吡咯、哌啶、噁唑烷、哌嗪、二氧戊环、二氧六环、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-1,1-二氧化物、四氢吡喃、噻吩环、n-烷基吡咯环、呋喃环、噻唑环、咪唑环、噁唑环、吡咯环、吡唑环、三唑环、四唑环、异噁唑环、噁二唑环、噻二唑环、吡啶环、哒嗪环、嘧啶环、吡嗪环；其中r
a0
、r
b0
各自独立地为氢或c
1-3
烷基。
[0022]
在另一优选例中，所述4到7元或5到7元饱和或不饱和单杂环选自：氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡咯、哌啶、噁唑烷、哌嗪、二氧戊环、二氧六环、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-1,1-二氧化物或四氢吡喃。
[0023]
在另一优选例中，所述5至6元单环杂芳基环选自：噻吩环、n-烷环吡咯环、呋喃环、噻唑环、咪唑环、噁唑环、吡咯环、吡唑环、三唑环、1,2,3-三唑环、1,2,4-三唑环、1,2,5-三唑环、1,3,4-三唑环、四唑环、异噁唑环、噁二唑环、1,2,3-噁二唑环、1,2,4-噁二唑环、1,2,5-噁二唑环、1,3,4-恶二唑环、噻二唑环、吡啶环、哒嗪环、嘧啶环、吡嗪环。
[0024]
在另一优选例中，所述桥杂环为含有4元、5元或6元环的双环桥杂环。
[0025]
在另一优选例中，所述螺杂环为含有4元、5元或6元环的双环螺杂环。
[0026]
在另一优选例中，n为0时，r2与r4连接形成仅含氮杂原子的4到7元饱和单杂环。
[0027]
在另一优选例中，n为0时，r1与r3连接形成仅含氮杂原子的4到7元饱和单杂环。
[0028]
在另一优选例中，n为0时，r3与r1、r4连接形成仅含氮杂原子的双桥杂环，或r2与r1、r4连接形成仅含氮杂原子的双桥杂环。
[0029]
在另一优选例中，n为1时，ra与r1以及rb与r4连接，共同形成仅含氮杂原子的双螺杂环。
[0030]
在另一优选例中，n为1时，ra分别与r1、r4连接，共同形成仅含氮杂原子的双桥杂环。
[0031]
在另一优选例中，n为1时，r2、r4连接形成仅含氮杂原子的5到7元饱和单杂环。
[0032]
在另一优选例中，r5、r6为氢。
[0033]
在另一优选例中，z为n或cr
b1
；其中r
b1
为氢或卤素(优选氟、氯、溴)。
[0034]
在另一优选例中，z为cr
b1
；其中r
b1
为卤素(优选氟、氯、溴)。
[0035]
在另一优选例中，x为一个键或nh。
[0036]
在另一优选例中，为式(a)、式(b)或式(c)所示结构：
[0037][0038]
式中，m11、m21各自独立地为1、2、3或4；m71为1、2或3；
[0039]
m12、m22各自独立地为0、1、2、3或4；m72为0、1、2或3；
[0040]ra1
、r
a2
、r
a11
各自独立地为卤素、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、羟基取代的c
1-8
烷基(优选为羟基
取代的c
1-6
烷基、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)；
[0041]
r1、r2、r3、r4、ra、rb如上所定义。
[0042]
在另一优选例中，为式(d)、式(e)或式(f)所示结构：
[0043][0044]
式中，m31、m32、m41、m42、m61、m62各自独立地为0、1、2或3；
[0045]
m33、m34、m43、m44、m63、m64各自独立地为0、1、2或3；
[0046]ra3
、r
a4
、r
a5
、r
a6
、r
a9
、r
a10
各自独立地为卤素、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、羟基取代的c
1-8
烷基(优选为羟基取代的c
1-6
烷基、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)；
[0047]
r2、r3如上所定义。
[0048]
在另一优选例中，为式(g)所示结构：
[0049][0050]
式中，m51、m52各自独立地为0、1、2或3；
[0051]
m53、m54各自独立地为0、1、2、3或4；
[0052]ra7
、r
a8
各自独立地为卤素、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、羟基取代的c
1-8
烷基(优选为羟基取代的c
1-6
烷基、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)；
[0053]
r2、r3如上所定义。
[0054]
在另一优选例中，m11为1、2、3或4；r3为氢、卤素或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；m12为0。
[0055]
在另一优选例中，m11为1、2、3或4；r3为氢；m12为1、2、3或4；r
a1
为卤素或c
1-8
烷基
(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0056]
在另一优选例中，m21为1、2、3或4；r2为氢；r4为氢或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；m22为0、1、2、3或4；r
a2
为卤素或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0057]
在另一优选例中，m21为1、2、3或4；r2、r4为氢；m22为0。
[0058]
在另一优选例中，m71为1、2或3；ra、rb为氢；m72为0。
[0059]
在另一优选例中，m31、m32各自独立地为0、1、2或3；m33、m34为0；r3为氢、卤素或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0060]
在另一优选例中，m31、m32各自独立地为1或2；m33、m34为0；r3为氢。
[0061]
在另一优选例中，m31为1；m32为1或2；m33、m34为0；r3为氢。
[0062]
在另一优选例中，m41、m42各自独立地为0、1、2或3；m43、m44为0；r2为氢、卤素或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0063]
在另一优选例中，m41、m42为1；m43、m44为0；r2为氢。
[0064]
在另一优选例中，m61、m62各自独立地为0、1、2或3；m63、m64为0；r2、r3各自独立地为氢、卤素或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0065]
在另一优选例中，m61、m62为1；m63、m64为0；r2、r3为氢。
[0066]
在另一优选例中，m51、m52各自独立地为1或2；m53、m54为0；r2、r3为氢。
[0067]
在另一优选例中，x为一个键或nr
a1
；其中r
a1
为氢或c
1-3
烷基。
[0068]
在另一优选例中，a为c
6-10
芳基(优选苯基)或5至6元单环杂芳基环；a任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代，所述任选地被取代是指环原子(包括碳原子和n原子)上的氢被取代基所取代。
[0069]
在另一优选例中，x为nh；a为c
6-10
芳基(优选苯基)或5至6元单环杂芳基环；a任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代，所述任选地被取代是指环原子(包括碳原子和n原子)上的氢被取代基所取代。
[0070]
在另一优选例中，x为一个键；a为5至6元单环杂芳基环；a任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代，所述任选地被取代是指环原子(包括碳原子和n原子)上的氢被取代基所取代。
[0071]
在另一优选例中，所述5至6元单环杂芳基环为：噻吩环、n-烷环吡咯环、呋喃环、噻唑环、咪唑环、噁唑环、吡咯环、吡唑环、三唑环、1,2,3-三唑环、1,2,4-三唑环、1,2,5-三唑环、1,3,4-三唑环、四唑环、异噁唑环、噁二唑环、1,2,3-噁二唑环、1,2,4-噁二唑环、1,2,5-噁二唑环、1,3,4-恶二唑环、噻二唑环、吡啶环、哒嗪环、嘧啶环或吡嗪环。
[0072]
在另一优选例中，所述5至6元单环杂芳基环选自：
[0073][0073]
上述5至6元单环杂芳基环任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代，所述任选地被取代是指环原子(包括碳原子和n原
子)上的氢被取代基所取代。
[0074]
在另一优选例中，x为nh；a选自b1组中结构。
[0075]
在另一优选例中，x为一个键；a选自b1或b2组中结构。
[0076]
在另一优选例中，x为nh；a为c
6-10
芳基(优选苯基)或5至6元单环杂芳基环；a任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代；所述任选地被取代是指环原子(包括碳原子和n原子)上的氢被取代基所取代；
[0077]
为式(a)所示结构；其中式(a)中各基团如上所定义；
[0078]
r1为氢或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0079]
在另一优选例中，x为nh；a选自b1组中结构；
[0080]
为式(a)所示结构；其中式(a)中各基团如上所定义；
[0081]
r1为氢或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0082]
在另一优选例中，x为一个键；a为5至6元单环杂芳基环；a任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代；所述任选地被取代是指环原子(包括碳原子和n原子)上的氢被取代基所取代；
[0083]
为式(a)所示结构；其中式(a)中各基团如上所定义；
[0084]
r1为氢或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0085]
在另一优选例中，x为一个键；a选自b1或b2组中结构；
[0086]
为式(a)所示结构；其中式(a)中各基团如上所定义；
[0087]
r1为氢或c
1-8
烷基，优选地r1为c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)。
[0088]
在另一优选例中，m11为3。
[0089]
在另一优选例中，式(d)、式(e)、式(f)或式(g)选自：
[0090][0091]
在另一优选例中，式(a)选自c1组中结构。
[0092]
在另一优选例中，c1组结构为：
[0093][0094]
在另一优选例中，式(b)选自：
[0095][0096]
在另一优选例中，式(c)选自：
[0097][0098]
本发明第二方面提供了一种式(ii)所示的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或前药：
[0099][0100]
式中，y为一个键、nr
a1
、s、so、so2或o；其中r
a1
为氢、羟基或c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)；
[0101]
b为c
6-10
芳基(优选苯基)、4至7元饱和或不饱和单杂环、5至6元单环杂芳基环、8至10元双环杂芳基环；
[0102]
q为n或cr
b1
；其中r
b1
为氢、卤素(优选氟、氯、溴)、氰基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)或c
3-8
环烷氧基(优选为c
3-6
环烷氧基)；
[0103]
z1、z2、z3、z4中的三个为ch，一个为n；或z1、z2、z3、z4均为ch；
[0104]
r5、r6各自独立地为氢、卤素(优选氟、氯、溴)、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)或c
3-8
环烷氧基(优选为c
3-6
环烷氧基)；
[0105]
r7、r9各自独立地为氢、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)或c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)；
[0106]
r8为氢、卤素、氰基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)或c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)或nr
a0rb0
；其中r
a0
、r
b0
各自独立地为氢、乙酰基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)；
[0107]
j为0、1、2、3或4；
[0108]
所述烷基、环烷基、烷氧基、环烷氧基、芳基、饱和或不饱和单杂环、单环杂芳基环、双环杂芳基环为未取代的或被1、2或3个选自下组的取代基所取代：卤素、羟甲基、羟乙基、羟基、羧基、-o(ch2)
p
oc
1-8
烷基、-o(ch2)
p
oh、-(ch2)
p
oc
1-8
烷基、4至6元饱和单杂环、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、卤代c
3-8
环烷基(优选为卤代c
3-6
环烷基)、羟基取代的c
1-8
烷基(优选为羟基取代的c
1-6
烷基，更优选为羟基取代的c
1-3
烷基)、nr
a0rb0
、-c(o)oc
1-6
烷基、乙酰基、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷氧基(优选为卤代c
1-6
烷氧基，更优选为卤代c
1-3
烷氧基)、-so2c
1-8
烷基(优选为-so2c
1-6
烷基，更优
选为-so2c
1-3
烷基)、c
6-10
芳基(优选苯基)、5至6元单环杂芳基或-y-l；其中y为(ch2)q或c(o)；l为4至6元饱和单杂环或5至6元单环杂芳基环；q为1、2或3；r
a0
、r
b0
各自独立地为氢、乙酰基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)。
[0109]
在另一优选例中，y为一个键或nr
a1
；其中r
a1
为氢、c
1-3
烷基。
[0110]
在另一优选例中，b为苯基或吡唑环。
[0111]
在另一优选例中，y为一个键；b为5至6元单环杂芳基环；所述5至6元单环杂芳基环任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代。
[0112]
在另一优选例中，y为一个键；b选自b2组中结构。
[0113]
在另一优选例中，y为一个键；b为吡唑环；所述吡唑环任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代。
[0114]
在另一优选例中，y为nr
a1
；其中r
a1
为氢、c
1-3
烷基；b为苯基或5至6元单环杂芳基环；所述b任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代，所述任选地被取代是指环原子(包括碳原子和n原子)上的氢被取代基所取代。
[0115]
在另一优选例中，y为nr
a1
；其中r
a1
为氢、c
1-3
烷基；b为苯基或吡唑环；所述苯基或吡唑环任选地被1、2或3个选自a1组的取代基所取代。
[0116]
在另一优选例中，y为nr
a1
；其中r
a1
为氢、c
1-3
烷基；b选自b1组中结构。
[0117]
在另一优选例中，r7、r9各自独立地为氢、c
1-3
烷基、卤代c
1-3
烷基或c
3-6
环烷基。
[0118]
本发明中，a1组的取代基为：卤素、-o(ch2)
p
oc
1-8
烷基、-o(ch2)
p
oh、-(ch2)
p
oc
1-8
烷基、4至6元饱和单杂环、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、卤代c
3-8
环烷基(优选为卤代c
3-6
环烷基)、羟基取代的c
1-8
烷基(优选为羟基取代的c
1-6
烷基，更优选为羟基取代的c
1-3
烷基)、羟甲基、羟乙基、羟基、羧基、nr
a0rb0
、-c(o)oc
1-6
烷基、乙酰基、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷氧基(优选为卤代c
1-6
烷氧基，更优选为卤代c
1-3
烷氧基)、-so2c
1-8
烷基(优选为-so2c
1-6
烷基，更优选为-so2c
1-3
烷基)、c
6-10
芳基(优选苯基)、5至6元单环杂芳基或-y-l；其中y为(ch2)q或c(o)；l为4至6元饱和单杂环；p、q各自独立地为1、2或3；r
a0
、r
b0
各自独立地为氢、乙酰基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)。
[0119]
在另一优选例中，a1组取代基中的4至6元饱和单杂环选自氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡咯、哌啶、噁唑烷、哌嗪、二氧戊环、二氧六环、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-1,1-二氧化物或四氢吡喃。
[0120]
在另一优选例中，a1组取代基中的4至6元饱和单杂环为未取代的或被1、2或3个选自下组的取代基所取代：卤素、羟基、c
1-3
烷基、o＝、nr
a0rb0
、羟甲基、羟乙基、羟丙基、羧基、-c(o)oc
1-3
烷基、乙酰基、卤代c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、c
3-6
环烷基、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡咯、哌啶、噁唑烷、哌嗪、二氧戊环、二氧六环、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-1,1-二氧化物、四氢吡喃、噻吩环、n-烷基吡咯环、呋喃环、噻唑环、咪唑环、噁唑环、吡咯环、吡唑环、三唑环、四唑环、异噁唑环、噁二唑环、噻二唑环、吡啶环、哒嗪环、嘧啶环、
吡嗪环；其中r
a0
、r
b0
各自独立地为氢或c
1-3
烷基。
[0121]
在另一优选例中，a1组的取代基为氟、氯、溴、羟甲基、羟乙基、羟基、羧基、-o(ch2)
p
oc
1-3
烷基、-o(ch2)
p
oh、-(ch2)
p
oc
1-3
烷基、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡咯、哌啶、噁唑烷、哌嗪、二氧戊环、二氧六环、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-1,1-二氧化物、四氢吡喃、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、一氯乙基、二氯甲基、1,2-二氯乙基、一溴乙基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、一氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、一氯环丙基、二氯环丙基、三氯环丙基、一氟环丙基、二氟环丙基、三氟环丙基、nr
a0rb0
、-c(o)oc
1-3
烷基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、一氟甲氧基、一氟乙氧基、二氟甲氧基、二氟乙氧基、苯基、吡啶基或-y-l；其中y为(ch2)q或c(o)；l为氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡咯、哌啶、噁唑烷、哌嗪、二氧戊环、二氧六环、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-1,1-二氧化物、四氢吡喃；p为1、2或3；q为1；r
a0
、r
b0
各自独立地为氢、乙酰基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基取代的c
1-3
烷基。
[0122]
在另一优选例中，b1组结构为：
[0123]
[0124]
在另一优选例中，b2组结构为：
[0125]
[0126]
在另一优选例中，式(i)化合物选自d1组中结构。
[0127]
在另一优选例中，d1组结构为：
[0128]
[0129][0130]
在另一优选例中，式(ii)化合物选自d2组中结构。
[0131]
在另一优选例中，d2组结构为：
[0132][0133]
本发明第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一或第二方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药；以及药学可接受的载体或赋形剂。
[0134]
本发明第四方面提供了本发明第一或第二方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药或本发明第三方面所述药物组合物在制备激酶抑制剂药物中的应用。
[0135]
在另一优选例中，所述药物用作btk抑制剂。
[0136]
本发明第五方面提供了本发明第一或第二方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药或本发明第三方面所述药物组合物在制备由b细胞介导的疾病的应用。
[0137]
本发明第六方面提供了一种治疗由b细胞介导的疾病的方法，包括给予所需患者治疗有效量的本发明第一或第二方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药，或本发明第三方面所述药物组合物。
[0138]
本发明第七方面提供了一种治疗由b细胞介导的疾病的方法，包括给予所需患者治疗有效量的本发明第一或第二方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药，以及另一种治疗活性试剂。
[0139]
在另一优选例中，由b细胞介导的疾病选自：肿瘤疾病、增殖性疾病、变态反应性疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病。
[0140]
在另一优选例中，由b细胞介导的疾病选自：实体瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、骨关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、类风湿性脊椎炎和痛风性关节炎。
[0141]
在另一优选例中，由b细胞介导的疾病为实体瘤。
[0142]
在另一优选例中，所述实体瘤为选自淋巴瘤、软组织肉瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤中的至少一种。
[0143]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
[0144]
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了这类4,6,7-三取代的1,2-二氢吡
咯并[3,4-c]吡啶/嘧啶-3-酮衍生物对btk wt等酶以及pbtk y223和tnfα等细胞具有较高的抑制活性。因此该系列化合物有望开发成为用于治疗肿瘤的药物。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0145]
本发明中相同符号所表示的含义除非本发明具有特别说明，应理解为均具有相同的含义。另外，本发明中的各术语(包括取代基简写、试剂名称缩写等)若未特别声明应理解为本领域通常的含义。
[0146]
术语定义
[0147]
如本文所用，“烷基”指直链和支链的饱和的脂族烃基，c
1-8
烷基为包含1至8个碳原子的烷基，可优选为c
1-6
烷基或c
1-3
烷基，定义类似；烷基非限制性的例子包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。
[0148]
如本文所用，“环烷基”指饱和或部分不饱和单环环状烃基，“c
3-8
环烷基”是指包含3至8个碳原子的环烃基，可优选为c
3-6
环烷基，定义类似；环烷基的非限制性实施例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等，优选环丙基、环戊基、环己烯基。
[0149]
如本文所用，“螺杂环”指单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环烃，其中一个或两个环原子选自氮、氧或s(o)n(其中n是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。根据环的数目将螺杂环分为双螺杂环或多螺杂环，优选双螺杂环。更优选为4元/5元、5元/5元或5元/6元双螺杂环。例如：
[0150][0151]
如本文所用，“桥杂环”指共用两个或两个以上原子的多环基团，其中一个或多个环原子选自氮、氧或s(o)n(其中n是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。这些可以含有一
个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为双环或三环桥杂环。例如：
[0152][0153]
如本文所用，“c
1-8
烷氧基”指-o-(c
1-8
烷基)，其中烷基的定义如上所述。优选c
1-6
烷氧基，更优选c
1-3
烷氧基。非限制性实施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、戊氧基等。
[0154]
如本文所用，“c
3-8
环烷氧基”指-o-(c
3-8
环烷基)，其中环烷基的定义如上所述。优选c
3-6
环烷氧基。非限制性实施例包含环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
[0155]
如本文所用，“c
6-10
芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，指含有6至10个碳原子的芳基；优选苯基和萘基，最优选苯基。
[0156]
如本文所用，“一个键”指由其连接的两个基团通过一个共价键连接。
[0157]
如本文所用，“卤素”指氟、氯、溴或碘。
[0158]
如本文所用，“卤代”指基团中一个或多个(如1、2、3、4或5个)氢被卤素所取代。
[0159]
例如，“卤代c
1-8
烷基”指烷基被一个或多个(如1、2、3、4或5个)卤素取代，其中烷基的定义如上所述。选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基。卤代c
1-8
烷基的例子包括(但不限于)一氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、一氯乙基、1,2-二氯乙基、三氯乙基、一溴乙基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、一氟乙基、二氟乙基、三氟乙基等。
[0160]
又例如，“卤代c
1-8
烷氧基”指烷氧基被一个或多个(如1、2、3、4或5个)卤素取代，其中烷氧基的定义如上所述。优选为卤代c
1-6
烷氧基，更优选为卤代c
1-3
烷氧基。卤代c
1-8
烷氧基的例子包括(但不限于)三氟甲氧基、三氟乙氧基、一氟甲氧基、一氟乙氧基、二氟甲氧基、二氟乙氧基等。
[0161]
又例如，“卤代c
3-8
环烷基”指环烷基被一个或多个(如1、2、3、4或5个)卤素取代，其中环烷基的定义如上所述。优选为卤代c
3-6
环烷基。卤代c
3-8
环烷基的例子包括(但不限于)三氟环丙基、一氟环丙基、一氟环己基、二氟环丙基、二氟环己基等。
[0162]
如本文所用，“氘代c
1-8
烷基”指烷基被一个或多个(如1、2、3、4或5个)氘原子取代，其中烷基的定义如上所述。优选为氘代c
1-6
烷基，更优选为氘代c
1-3
烷基。氘代c
1-8
烷基的例子包括(但不限于)单氘代甲基、单氘代乙基、二氘代甲基、二氘代乙基、三氘代甲基、三氘代乙基等。
[0163]
如本文所用，“氨基”指nh2，“氰基”指cn，“硝基”指no2，“苄基”指-ch
2-苯基，“氧代基”指＝o，“羧基”指-c(o)oh，“乙酰基”指-c(o)ch3，“羟甲基”指-ch2oh，“羟乙基”指-ch2ch2oh，“羟基”指-oh，“硫醇”指sh，“亚环丙基”结构为：
[0164]
如本文所用，“杂芳基环”与“杂芳基”可互换使用，是指具有5到10个环原子，优选5
或6元单环杂芳基或8至10元双环杂芳基；环阵列中共享6、10或14个π电子；且除碳原子外还具有1到5个杂原子的基团。“杂原子”是指氮、氧或硫。
[0165]
如本文所用，“4至7元饱和单杂环”是指4至7元单环中的1、2或3个碳原子被选自氮、氧或s(o)
t
(其中t是整数0至2)的杂原子所取代，但不包括-o-o-、-o-s-或-s-s-的环部分，其余环原子为碳；优选4至6元，更优选5至6元。4至7元饱和单杂环的实例包括(但不限于)环氧丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡咯、哌啶、吡咯啉、噁唑烷、哌嗪、二氧戊环、二氧六环、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-1,1-二氧化物、四氢吡喃等。
[0166]
如本文所用，“5至6元单环杂芳基环”是指含5至6个环原子的单杂芳基环，例如包括(但不限于)：噻吩环、n-烷环吡咯环、呋喃环、噻唑环、咪唑环、噁唑环、吡咯环、吡唑环、三唑环、1,2,3-三唑环、1,2,4-三唑环、1,2,5-三唑环、1,3,4-三唑环、四唑环、异噁唑环、噁二唑环、1,2,3-噁二唑环、1,2,4-噁二唑环、1,2,5-噁二唑环、1,3,4-恶二唑环、噻二唑环、吡啶环、哒嗪环、嘧啶环、吡嗪环等。
[0167]
如本文所用，“8至10元双环杂芳基环”是指含8至10个环原子的双杂芳基环，例如包括(但不限于)：苯并呋喃、苯并噻吩、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、吲唑、苯并噻唑、苯并咪唑、喹唑啉、喹喔啉、噌啉、酞嗪。
[0168]
如本文所用，“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为1～5个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
[0169]
如本文所用，上述任一基团可以是取代的或未取代的。上述基团为取代时，取代基优选为1至5个(更优选1至3个)以下基团，独立地选自卤素、-o(ch2)
p
oc
1-8
烷基、-o(ch2)
p
oh、-(ch2)
p
oc
1-8
烷基、4至6元饱和单杂环、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
3-8
环烷基(优选为c
3-6
环烷基)、卤代c
1-8
烷基(优选为卤代c
1-6
烷基，更优选为卤代c
1-3
烷基)、卤代c
3-8
环烷基(优选为卤代c
3-6
环烷基)、羟基取代的c
1-8
烷基(优选为羟基取代的c
1-6
烷基，更优选为羟基取代的c
1-3
烷基)、羟甲基、羟乙基、羟基、羧基、nr
a0rb0
、-c(o)oc
1-6
烷基、乙酰基、c
1-8
烷氧基(优选为c
1-6
烷氧基，更优选为c
1-3
烷氧基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)、卤代c
1-8
烷氧基(优选为卤代c
1-6
烷氧基，更优选为卤代c
1-3
烷氧基)、-so2c
1-8
烷基(优选为-so2c
1-6
烷基，更优选为-so2c
1-3
烷基)、c
6-10
芳基(优选苯基)、5至6元单环杂芳基、或-y-l；其中y为(ch2)q或c(o)；l为4至6元饱和单杂环或5至6元单环杂芳基环；p、q各自独立地为1、2或3；r
a0
、r
b0
各自独立地为氢、乙酰基、c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷基)、c
1-8
烷氧基取代的c
1-8
烷基(优选为c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基，更优选为c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基)。
[0170]
本文以上所述的各类取代基团其自身也是可以被本文所描述的基团取代。
[0171]
本文所述的4至6元饱和单杂环被取代时，取代基的位置可处在它们可能的化学位置，示例性的单杂环的代表性的取代情况如下所示：
[0172][0172]
其中“sub”表示本文所述的各类取代基；表示与其他原子的连接。
[0173]
当本发明所述的4至6元饱和单杂环为取代基时，其自身也可以为取代或被1、2或3个选自下组的取代基所取代：卤素、羟基、c
1-3
烷基、o＝、nr
a0rb0
、羟甲基、羟乙基、羧基、-c(o)oc
1-3
烷基、乙酰基、卤代c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、c
3-6
环烷基、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡咯、哌啶、噁唑烷、哌嗪、二氧戊环、二氧六环、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-1,1-二氧化物、四氢吡喃、噻吩环、n-烷基吡咯环、呋喃环、噻唑环、咪唑环、噁唑环、吡咯环、吡唑环、三唑环、四唑环、异噁唑环、噁二唑环、噻二唑环、吡啶环、哒嗪环、嘧啶环、吡嗪环；其中r
a0
、r
b0
各自独立地为氢或c
1-3
烷基。
[0174]
所述“药学上可接受的盐”包括药学可接受的酸加成盐和药学可接受的碱加成盐。
[0175]“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其他副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。
[0176]“药学可接受的碱加成盐”，包括但不限于无机碱的盐如钠盐，钾盐，钙盐和镁盐等。包括但不限于有机碱的盐，比如铵盐，三乙胺盐，赖氨酸盐，精氨酸盐等。
[0177]
本发明中提及的“溶剂化物”是指本发明的化合物与溶剂形成的配合物。它们或者在溶剂中反应或者从溶剂中沉淀析出或者结晶出来。例如，一个与水形成的配合物称为“水合物”。式(i)化合物的溶剂化物属于本发明范围之内。
[0178]
本发明式(i)所示的化合物可以含有一个或多个手性中心，并以不同的光学活性形式存在。当化合物含有一个手性中心时，化合物包含对映异构体。本发明包括这两种异构体和异构体的混合物，如外消旋混合物。对映异构体可以通过本专业已知的方法拆分，例如结晶以及手性色谱等方法。当式(i)化合物含有多于一个手性中心时，可以存在非对映异构
体。本发明包括拆分过的光学纯的特定异构体以及非对映异构体的混合物。非对映异构体可由本专业已知方法拆分，比如结晶以及制备色谱。
[0179]
本发明包括上述化合物的前药。前药包括已知的氨基保护基和羧基保护基，在生理条件下被水解或经由酶反应释放得到母体化合物。具体的前药制备方法可参照(saulnier，m.g.；frennesson，d.b.；deshpande，m.s.；hansel，s.b and vysa，d.m.bioorg.med.chem lett.1994，4，1985-1990；和greenwald，r.b.；choe，y.h.；conover，c.d.；shum，k.；wu，d.；royzen，m.j.med.chem.2000，43，475.)。
[0180]
通常，本发明化合物或其药学可接受的盐、或其溶剂化物、或其立体异构体、或前药可以与一种或多种药用载体形成适合的剂型施用。这些剂型适用于口服、直肠给药、局部给药、口内给药以及其他非胃肠道施用(例如，皮下、肌肉、静脉等)。例如，适合口服给药的剂型包括胶囊、片剂、颗粒剂以及糖浆等。这些制剂中包含的本发明的化合物可以是固体粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液或是混悬液；油包水或水包油的乳剂等。上述剂型可由活性化合物与一种或多种载体或辅料经由通用的药剂学方法制成。上述的载体需要与活性化合物或其他辅料兼容。对于固体制剂，常用的无毒载体包括但不限于甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、葡萄糖、蔗糖等。用于液体制剂的载体包括水、生理盐水、葡萄糖水溶液、乙二醇和聚乙二醇等。活性化合物可与上述载体形成溶液或是混悬液。
[0181]
本发明的组合物以符合医学实践规范的方式配制，定量和给药。给予化合物的“治疗有效量”由要治疗的具体病症、治疗的个体、病症的起因、药物的靶点以及给药方式等因素决定。
[0182]
如本文所用，“治疗有效量”是指将引起个体的生物学或医学响应，例如降低或抑制酶或蛋白质活性或改善症状、缓解病症、减缓或延迟疾病进程或预防疾病等的本发明化合物的量。
[0183]
如本文所用，“药学可接受的载体”是指无毒、惰性、固态、半固态的物质或液体灌装机、稀释剂、封装材料或辅助制剂或任何类型辅料，其与患者相兼容，最好为哺乳动物，更优选为人，其适合将活性试剂输送到目标靶点而不终止试剂的活性。
[0184]
如本文所用，“患者”是指一种动物，最好为哺乳动物，更好的为人。术语“哺乳动物”是指温血脊椎类哺乳动物，包括如猫、狗、兔、熊、狐狸、狼、猴子、鹿、鼠、猪和人类。
[0185]
如本文所用，“治疗”是指减轻、延缓进展、衰减、预防，或维持现有疾病或病症(例如癌症)。治疗还包括将疾病或病症的一个或多个症状治愈、预防其发展或减轻到某种程度。
[0186]
制备方法
[0187]
本发明提供了式(i)化合物的制备方法，本发明中的化合物可以通过多种合成操作制备，这些化合物的示例性制备方法可以包括(但不限于)下文所述的流程。
[0188]
较佳地，本发明式(i)化合物可以通过以下方案及实施例中所述的示例性方法以及本领域技术人员所用的相关公开文献操作完成。
[0189]
在具体操作过程中，可以根据需要对方法中的步骤进行扩展或合并。
[0190]
方案1：
[0191][0192]
步骤1：化合物1a与相应的胺(伯胺或仲胺)，在碱性条件下发生亲核取代反应。
[0193]
步骤2：吡啶环上的氯与相应的胺，在碱性条件下，经钯催化剂催化发生buchwald偶联反应。
[0194]
步骤3：胺在酸性条件下脱去保护基。
[0195]
步骤4：环a上的二级胺与酰氯在碱性条件下发生酰胺缩合反应。
[0196]
方案2：
[0197][0198]
步骤1、步骤3、步骤4同方案1的步骤1、步骤3、步骤4。步骤2：吡啶环上的氯与相应的硼酸在碱性条件下经钯催化剂催化发生suzuki偶联反应。
[0199]
以上各步骤中的反应均是本领域技术人员已知的常规反应。如无特殊说明，合成路线中所使用的试剂和原料化合物均可市购得到，或本领域技术人员根据所设计的不同化合物结构参考已知方法制备得到。
[0200]
与现有技术相比，本发明的主要优点在于：
[0201]
提供了一系列结构新颖的4,6,7-三取代的1,2-二氢吡咯并[3,4-c]吡啶/嘧啶-3-酮衍生物对btk wt酶以及pbtk y223等细胞具有较高的抑制活性，并且对egfr wt的抑制活性较弱，具有明显的选择抑制性，可用作治疗肿瘤的药物。
[0202]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，本文所用的术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或同等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0203]
如本文所用，dmb为2,4-二甲氧基苄基，thf为四氢呋喃，ea为乙酸乙酯，pe为石油醚，ac2o为乙酸酐，nbs为n-溴代琥珀酰亚胺，dcm为二氯甲烷，aibn为偶氮二异丁腈，pd(dppf)cl2为1,1'-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯，tfa为三氟乙酸，tbscl为叔丁基二甲基氯硅烷，ncs为n-氯代丁二酰亚胺，dhp为二氢四氢吡喃，lialh4为氢化铝锂，pmb为对甲氧基苄基，lihmds为二(三甲基硅基)氨基锂，pd2(dba)3为三(二亚苄基丙酮)二钯，ruphos为2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯,dmap为4-二甲氨基吡啶，thp为四氢四氢吡喃，n-buli为正丁基锂，tmsotf为三氟甲磺酸三甲基硅酯，tebac为三乙基苄基氯化铵，hatu为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，dmf为二甲基甲酰胺，dmso为二甲基亚砜，diea为n,n-二异丙基乙胺，binap为(2r,3s)-2,2'-双二苯膦基-1,1'-联萘。
[0204]
如本文所用，室温是指约为20-25℃。
[0205]
中间体1a的制备
[0206][0207]
步骤1：化合物1a-1(6.0g,30.0mmol)的thf(80ml)溶液在-78℃下加入n-buli(27ml,66mmol)和dipa(6.6g,66mmol)，混合物搅拌1h后加入dmf(10ml)并升至室温继续搅拌2h。lc-ms跟踪至反应完全。向体系中加hcl(2n)调ph至5-6，乙酸乙酯萃取，有机层经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，combiflash纯化得6.8g化合物1a-2。ms m/z(esi):238[m h]

。
[0208]
步骤2：化合物1a-2(6.8g,30.0mmol)的1,4-二氧六环(80ml)加入化合物1a.1(15g,90.0mmol)、醋酸(2ml)和nabh(oac)3(18.9g,90.0mmol)，混合物于50℃搅拌过夜。lc-ms跟踪至反应完全。反应液减压蒸干，加饱和食盐水洗涤，经dcm萃取，有机层干燥、浓缩，combiflash纯化得4.8g化合物1a。ms m/z(esi):371[m h]

。
[0209]
中间体1b的制备
[0210][0211]
步骤1：化合物1b-1(1.63g,16.0mmol)和化合物1b.1(1.8g,16.0mmol)的thf(30ml)溶液加入三苯基膦(5.03g,19.2mmol)，随后逐滴加入diad(4.2g,20.7mmol)的四氢呋喃(20ml)溶液，混合物室温搅拌20h，lc-ms跟踪至反应完全。混合物浓缩后经combiflash纯化得4.2g化合物1b-2。ms m/z(esi):198[m h]

。
[0212]
步骤2：化合物1b-2(3.4g,17.2mmol)的乙醇(50ml)溶液加入铁粉(4.8g,86.3mmol)、氯化铵(4.6g,86.3mmol)的水(20ml)溶液，混合物于90℃搅拌2h，lc-ms跟踪至反应完全。反应液过滤，滤液浓缩化合物1b直接用于下一步反应。ms m/z(esi):168[m h]

。
[0213]
中间体1c的制备
[0214][0215]
化合物1c-1(500mg,2.58mmol)的乙腈(15ml)溶液加入化合物1c.1(128mg,0.52mmol)和18-crown-6(470mg,3.1mmol)，混合物于90℃搅拌过夜。反应液过滤，滤液减压蒸干得400mg黄色油状化合物即为1c，直接用于下一步反应。ms m/z(esi):244.0[m h]

。
[0216]
中间体1d的制备
[0217][0218]
步骤1：制备方法同化合物1b，不同的是将化合物1b制法中的化合物1b-2换成化合物1d-1。ms m/z(esi):191.9[m h]

。
[0219]
步骤2：化合物1d-2(1.5g,7.9mmol)的乙酸乙酯(50ml)溶液加入(boc)2o(2.1g,9.5mmol)和dipea，混合物于室温搅拌3h，lc-ms跟踪至反应完全。反应液浓缩得化合物1d-3直接用于下一步。ms m/z(esi):291[m h]

。
[0220]
步骤3：制备方法同化合物1-5，不同的是将化合物1-5制法中的化合物1-4与化合物1.3换成化合物1d-3与化合物1d.1。ms m/z(esi):297[m h]

。
[0221]
步骤4：制备方法同化合物2-3，不同的是将化合物2-3制法中的化合物2-2换成化合物1d-4。ms m/z(esi):197[m h]

。
[0222]
中间体1e的制备
[0223][0224]
化合物1e-1(2g,10.0mmol)、苯甲醛(1.59g,15mmol)、醋酸(10ml)的thf(50ml)溶液，混合物搅拌1h后分批加入nabh3cn(1.89g,30mmol)并在室温下继续搅拌1h。lc-ms跟踪至反应完全。反应液饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经dcm萃取，有机层干燥、浓缩，combiflash纯化得油状化合物1e。ms m/z(esi):291[m h]

。
[0225]
实施例2 6-(1-丙烯酰基哌啶-3-基氨基)-7-氟-4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-2)的制备
[0226][0227]
步骤1：化合物1a(740mg,2mmol)的nmp(10ml)溶液加入化合物2.1(600mg,3mmol)和dipea(780mg,6mmol)，混合物在氩气氛围下于180℃微波反应30min。lc-ms跟踪至反应完全。反应液冷却至室温，加dcm稀释，分别经水与饱和食盐水洗涤，有机层干燥、浓缩后经combiflash纯化得300mg化合物2-1。ms m/z(esi):535[m h]

。
[0228]
步骤2：化合物2-1(250mg,0.5mmol)、化合物2.2(102mg,0.6mmol)、pd2(dba)3(45mg,0.05mmol)、xantphos(54mg,0.1mmol)、碳酸铯(326mg,1mmol)的1,4-二氧六环(15ml)溶液在氩气氛围下于160℃微波反应50min。lc-ms跟踪至反应完全。反应液冷却至室温，加ea稀释，分别经水与饱和食盐水洗涤，有机层干燥、浓缩后经combiflash纯化得270mg化合物2-2。ms m/z(esi):666[m h]

。
[0229]
步骤3：化合物2-2(270mg,0.4mmol)的tfa(5ml)溶液于110℃微波反应20min。lc-ms跟踪至反应完全。反应液加饱和食盐水洗涤，加饱和碳酸氢钠溶液调ph至7-8，dcm萃取，有机层干燥后浓缩得124mg化合物2-3直接用于下一步反应。ms m/z(esi):416[m h]

。
[0230]
步骤4：化合物2-3(83mg,0.2mmol)的dcm(10ml)溶液在氩气氛围下分别加入丙烯酰氯(18mg,0.2mmol)和dipea(80mg,0.6mmol)。混合物室温搅拌2h。lc-ms跟踪至反应完全。反应液经饱和食盐水洗涤，dcm萃取，有机层干燥、浓缩，纯化得化合物g-2。ms m/z(esi):470.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.54(s,1h),7.73(s,1h),7.48(d,j＝7.6hz,2h),6.81(d,j＝8.5hz,2h),6.60(s,1h),6.44(s,1h),6.00(d,j＝16.9hz,1h),5.52(s,1h),4.31(s,2h),4.05(m,4h),3.62(s,2h),3.31(s,2h),2.00(s,2h),1.77(s,1h),1.69(s,1h),1.46(s,1h).
[0231]
实施例3 6-(1-丙烯酰基氮杂环庚烷-3-基氨基)-7-氟-4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基氨基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-3)的制备
[0232][0233]
步骤1：制备方法同化合物2-1，不同的是将化合物2-1制法中化合物2.1换成化合物3.1。ms m/z(esi):549.3[m h]

。
[0234]
步骤2：制备方法同化合物2-2，不同的是将化合物2-2制法中化合物2-1换成化合物3-1。ms m/z(esi):680.5[m h]

。
[0235]
步骤3：化合物3-2(83mg,0.001mmol)的dcm(5ml)溶液中加入tfa(2ml)。混合物室温搅拌1h。lc-ms跟踪至反应完全。减压去除大部分tfa，加饱和碳酸氢钠溶液，调ph至7-8，dcm萃取，有机层合并后干燥、浓缩得化合物3-3，直接用于下一步反应。ms m/z(esi):580.3[m h]

。
[0236]
步骤4：制备方法同化合物g-2，不同的是将化合物g-2制法中化合物2-3换成化合
物3-3。ms m/z(esi):634.4[m h]

。
[0237]
步骤5：化合物3-4(70mg,0.11mmol)的tfa(3ml)溶液加入et3sih(0.2ml)，混合物加热至80℃搅拌2h。lc-ms跟踪至反应完全。减压去除大部分tfa，加饱和碳酸氢钠溶液调ph至7-8，乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥、浓缩后经prep-hplc纯化得4.5mg化合物g-3。ms m/z(esi):484[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.60(s,1h),8.15(d,j＝12hz,1h),7.60(d,j＝8.8hz,1h),7.54(d,j＝8.8hz,1h),6.60-7.05(m,4h),6.21(dd,j1＝2.4hz,j2＝16.4hz,0.5h),6.08(dd,j1＝2.4hz,j2＝16.4hz,0.5h),5.73(dd,j1＝2.4hz,j2＝10.4hz,0.5h),5.44(dd,j1＝2.4hz,j2＝10.4hz,0.5h),4.20-4.40(m,3h),3.78-4.05(m,4h),3.41-3.67(m,4h),3.30(s,3h),1.18-2.02(m,6h).
[0238]
实施例7 6-(1-丙烯酰基哌啶-3-基氨基)-7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-7)的制备
[0239][0240]
步骤1：化合物2-1(150mg,0.3mmol)、化合物7.1(150mg,0.5mmol)、pd(dppf)cl2(25mg,0.03mmol)、碳酸钾(130mg,0.9mmol)的1,4-二氧六环(10ml)和水(1ml)溶液的混合物至氩气氛围下于130℃微波反应30min。lc-ms跟踪至反应完全。减压蒸干溶剂，残留物经combiflash纯化得140mg化合物7-1。ms m/z(esi):581[m h]

。
[0241]
步骤2：化合物7-1(140mg,0.2mmol)的tfa(3ml)溶液在80℃搅拌3h。lc-ms跟踪至反应完全。反应液加饱和碳酸钠溶液调ph至7，经dcm萃取，饱和食盐水洗涤，有机层干燥浓缩得100mg化合物7-2。ms m/z(esi):331[m h]

。
[0242]
步骤3：制备方法同化合物g-2，不同的是将g-2制法中化合物2-3换成化合物7-2。经prep-hplc纯化得化合物g-7。ms m/z(esi):385[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.80(d,j＝59.2hz,1h),8.30(dd,j＝44.8,35.1hz,2h),7.00(s,1h),6.73(d,j＝81.8hz,1h),6.11(t,j＝18.1hz,1h),5.59(dd,j＝70.2,10.0hz,1h),4.84(d,j＝9.8hz,1h),4.32(s,1h),4.27
–
4.06(m,1h),4.01(s,1h),3.84(s,2h),3.01(s,1h),2.75(s,1h),1.97(s,1h),1.75(s,2h),1.48(s,1h).
[0243]
实施例8 6-(1-丙烯酰基哌啶-3-基氨基)-7-氟-4-(4-甲基-1h-吡唑-1-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-8)的制备
[0244][0245]
步骤1：制备方法同化合物2-2，不同的是将化合物2-2制法中化合物2.2换成化合物8.1。ms m/z(esi):581[m h]

。
[0246]
步骤2：制备方法同化合物2-3，不同的是将化合物2-3制法中化合物2-2换成化合
物8-1。ms m/z(esi):331[m h]

。
[0247]
步骤3：制备方法同化合物g-2，不同的是将化合物g-2制法中化合物2-3换成化合物8-2。ms m/z(esi):385.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.47
–
8.18(m,2h),7.52
–
7.47(m,1h),7.36
–
7.31(m,1h),7.09
–
6.73(m,2h),6.09
–
6.01(m,1h),5.66
–
5.49(m,1h),4.43
–
4.32(m,2h),3.93
–
3.90(m,1h),3.79
–
3.72(m,1h),3.03
–
2.84(m,1h),2.70
–
2.64(m,1h),2.75
–
2.61(m,1h),2.05(s,3h),1.96-1.94(m,1h),1.76
–
1.73(m,1h),1.44
–
1.35(m,1h).
[0248]
实施例26 6-(1-丙烯酰基-6-甲基哌啶-3-基氨基)-7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-26)的制备
[0249][0250]
步骤1：制备方法同化合物2-1，不同的是将化合物2-1制法中化合物2.1换成化合物26.1。ms m/z(esi):583.3[m h]

。
[0251]
步骤2：制备方法同化合物7-1，不同的是将化合物7-1制法中化合物2-1换成化合物26-1。ms m/z(esi):629.3[m h]

。
[0252]
步骤3：化合物26-2(100mg,0.159mmol)的hbr/hoac(4ml)溶液在40℃搅拌1h。lc-ms跟踪至反应完全。减压蒸干溶剂，残留物中加水与dcm萃取，水层冷冻干燥得85mg黄色固体化合物即为26-3。ms m/z(esi):345.2[m h]

。
[0253]
步骤4：制备方法同化合物g-2，不同的是将化合物g-2制法中化合物2-3换成化合物26-3。ms m/z(esi):399.3[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.80(d,j＝39.8hz,1h),8.46
–
8.23(m,2h),7.13
–
6.99(m,1h),6.85(dd,j＝16.6,10.2hz,1h),6.70(dd,j＝16.4,10.6hz,1h),6.21
–
6.04(m,1h),5.69(d,j＝10.1hz,1h),5.54(d,j＝10.3hz,1h),4.81(d,j＝11.8hz,1h),4.36(s,2h),4.05(d,j＝10.1hz,1h),3.87(s,3h),2.98(t,j＝12.7hz,1h),2.58(t,j＝11.8hz,1h),2.00
–
1.54(m,4h),1.20(dd,j＝29.8,6.6hz,3h).
[0254][0255]
化合物g-4、g-5、g-6，g-9至g-25、g-27、g-31至g-42是以中间体1a和不同的胺为原料，参照实施例2或实施例3的方法制备而成。
[0256]
化合物g-44至g-53、g-55至g-57是以中间体1a或中间体2-1和不同的硼酸为原料，
参照实施例7或实施例26的方法制备而成。
[0257]
化合物g-69参照实施例60的方法制备而成。
[0258]
[0259]
[0260]
[0261]
[0262][0263]
实施例58 2-(1-丙烯酰基哌啶-3-基氨基)-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮(g-58)的制备
[0264][0265]
步骤1：制备方法同化合物7-1，不同的是将化合物7-1制法中化合物2-1换成化合物58-1。ms m/z(esi):267.1[m h]

。
[0266]
步骤2：制备方法同化合物2-1，不同的是将化合物2-1制法中化合物1a换成化合物58-2。ms m/z(esi):431.2[m h]

。
[0267]
步骤3：化合物58-3(335mg,0.778mmol)、seo2(460mg,4.146mmol)和1,4-二氧六环(10ml)的混合物加热至100℃过夜。lc-ms跟踪至反应完全。反应液过滤、减压蒸干溶剂得600mg油状化合物即为58-4，直接用于下一步反应。ms m/z(esi):445.3[m h]

。
[0268]
步骤4：600mg粗产品化合物58-4、化合物1a.1(80mg,0.478mmol)、10ml二氯甲烷和5ml甲醇的混合物室温搅拌1h后加入nabh3cn(100mg,1.591mmol)，混合物室温搅拌30min后加热至50℃继续搅拌4h。lc-ms跟踪至反应完全。向体系中加水洗涤，dcm萃取，有机层干燥、浓缩，经prep-hplc纯化得黄色油状化合物58-5(60mg,13.7％产率)。ms m/z(esi):564.3[m h]

。
[0269]
步骤5：制备方法同化合物g-1，不同的是将g-1制法中化合物1-5换成化合物58-5。ms m/z(esi):368.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.97(s,1h),8.45(s,1h),7.77(s,1h),7.19(s,1h),6.66(dd,j＝16.8,10.6hz,1h),6.04(d,j＝16.4hz,1h),5.57(d,j＝11.0hz,1h),4.26(s,1h),4.15(s,2h),3.89(s,4h),2.00(d,j＝14.0hz,1h),1.79(d,j＝13.3hz,1h),1.66(d,j＝10.7hz,1h),1.48(d,j＝13.3hz,1h),1.24(s,1h).
[0270]
实施例59 2-(1-丙烯酰基哌啶-3-基氨基)-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基氨基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮(g-59)的制备
[0271][0272]
步骤1：制备方法同化合物2-1，不同的是将化合物2-1制法中化合物1a与化合物2.1换成化合物58-1与59.1。ms m/z(esi):460.2[m h]

。
[0273]
步骤2至步骤6的方法同实施例g-58的步骤2至步骤5(实施例59中步骤5与步骤6在
实施例58中合并为一步反应即步骤5)。最后经prep-hplc纯化得白色固体化合物g-59(90mg,65.2％产率)。ms m/z(esi):383.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.69
–
8.44(m,1h),8.32
–
8.02(m,1h),8.07-7.91(m,1h),7.86
–
7.40(m,2h),6.94
–
6.38(m,1h),6.22
–
5.92(m,1h),5.79
–
5.34(m,1h),4.53(dd,j＝69.7,10.3hz,0.5h),4.22
–
3.65(m,7.5h),3.17
–
2.97(m,1h),2.97
–
2.54(m,1h),1.98(s,1h),1.79(s,1h),1.70
–
1.35(m,2h).
[0274]
实施例60 6-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶3(2h)-酮(g-60)的制备
[0275][0276]
步骤1：制备方法同化合物2-1，不同的是将化合物2-1制法中化合物1a与化合物2.1换成化合物58-1与60.1。ms m/z(esi):460.2[m h]

。
[0277]
步骤2至步骤4的方法同实施例g-7的步骤1至步骤3。最后经prep-hplc纯化得白色固体化合物g-60(35mg,18.3％产率)。ms m/z(esi):399.2[m h] 。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.79-8.72(m,1h),8.44
–
8.13(m,2h),6.90
–
6.66(m,1h),6.20
–
6.02(m,1h),5.68-5.55(m,1h),4.63-4.41(m,1h),4.34(s,2h),4.18-4.05(m,2h),3.84(s,3h),3.13
–
2.88(m,4h),2.88
–
2.51(m,1h),2.00
–
1.71(m,3h),1.45(d,j＝12.0hz,1h).
[0278]
实施例61 7-氟-6-(甲基(1-丙炔酰基哌啶-3-基)氨基)-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-61)的制备
[0279][0280]
化合物61.1(25mg,0.35mmol)的mecn(10ml)溶液加入化合物60-3(100mg,0.29mmol)、hatu(168mg,0.44mmol)和dipea(75mg,0.58mmol)，混合物室温搅拌2h。lc-ms跟踪至反应完全。减压去除大部分溶剂后经prep-hplc纯化得黄色固体化合物g-61(2.58mg,2.2％产率)。ms m/z(esi):397.1[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.76(s,1h),8.37-8.27(m,2h),4.55-4.50(m,1h),4.41-4.20(m,4h),4.09-4.04(m,0.5h),3.85(s,3h),3.39-3.36(m,0.5h),3.14-3.10(m,0.5h),3.05-3.03(m,3h),2.88-2.86(m,0.5h),2.63-2.60(m,0.5h),2.04-1.84(m,3h),1.45-1.41(m,1h).
[0281]
实施例62 7-氟-6-(甲基(1-丙酰哌啶-3-基)氨基)-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-62)的制备
[0282][0283]
制备方法同化合物g-61，不同的是将化合物g-61制法中化合物61.1换成化合物62.1。ms m/z(esi):401.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.82-8.78(m,1h),8.39-8.21(m,2h),4.65-4.62(d,j＝12hz,0.5h),4.42-4.40(d,j＝8hz,0.5h),4.41(s,2h),4.24-4.22(m,0.5h),3.88-3.84(m,0.5h),3.88-3.84(m,4h),3.26-3.25(m,0.5h),3.08(m,3h),2.98-2.96(m,0.5h),2.72-2.70(m,1h),2.39-2.26(m,2h),1.91-1.76(m,3h),1.51-1.35(m,1h),1.05-0.91(m,3h).
[0284]
实施例63 6-((1-丙烯酰基哌-3-基)(甲基)氨基)-4-(1-(二氟甲基)-1h-吡唑-4-基)-7-氟-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-63)的制备
[0285][0286]
化合物g-63的步骤1至步骤3同实施例60的步骤2至步骤4。最后经prep-hplc纯化得化合物g-63。ms m/z(esi):435.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.33(d,j＝31.5hz,1h),8.51(t,j＝36.0hz,2h),7.82(t,j＝35.8hz,1h),6.92
–
6.69(m,1h),6.22
–
6.05(m,1h),5.71
–
5.47(m,1h),4.64(d,j＝12.1hz,1h),4.37(m,2h),4.07(m,2h),3.08(s,3h),2.99(m,1h),2.82(t,j＝11.4hz,1h),2.00
–
1.74(m,3h),1.46(d,j＝13.1hz,1h).
[0287]
实施例64 6-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7-氟-4-(1-(2-吗啉代乙基)-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4c]吡啶-3(2h)-酮(g-64)的制备
[0288][0289]
化合物g-64的制备方法同化合物g-63。ms m/z(esi):498.3[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.81(s,1h),8.29(s,1h),7.98(s,1h),6.71(dd,j＝16.8,10.3hz,1h),6.06(d,j＝17.5hz,1h),5.59(d,j＝10.6hz,1h),4.32(s,2h),4.20(m,4h),3.53(d,j＝4.5hz,4h),3.09(d,j＝3.2hz,3h),2.96
–
2.91(m,3h),2.74(t,j＝6.4hz,2h),2.41(m,4h),1.88(m,3h),1.51(m,1h).
[0290]
实施例65 6-((1-丙烯酰基-6-甲基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4c]吡啶-3(2h)-酮(g-65)的制备
[0291][0292]
化合物g-65的制备方法同化合物g-60。ms m/z(esi):413.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.77-8.72(d,j＝20hz,1h),8.36(m,1h),8.31(s,0.5h),8.18(s,0.5h),6.85-6.78(m,1h),6.04-6.03(m,1h),5.67-5.53(m,1h),4.78-4.76(m,0.5h),4.53-4.51(m,0.5h),4.33(s,2h),4.20-4.16(m,0.5h),4.06-4.03(m,0.5h),3.83(s,3h),3.27(m,1h),3.09(s,3h),2.89-2.86(m,1h),2.08-2.05(m,1h),1.71-1.67(m,3h),1.25-1.15(m,3h).
[0293]
实施例66 6-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7-氟-4-(2-甲基噻唑-5-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-66)的制备
[0294][0295]
化合物g-66的制备方法同化合物g-63。ms m/z(esi):416.2[m h]

。
[0296]
实施例67 6-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7-氟-4-(1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-67)的制备
[0297][0298]
步骤1：制备方法同化合物7-1，不同的是将化合物7-1制法中化合物2-1和化合物7.1换成化合物60-1和化合物67.1。ms m/z(esi):581[m h]

。
[0299]
步骤2：制备方法同化合物1-2，不同的是将化合物1-2制法中化合物1-1换成化合
物67-1。ms m/z(esi):652[m h]

。
[0300]
步骤3和步骤4同实施例60中步骤3与步骤4。最后经prep-hplc纯化得5mg固体化合物g-67。ms m/z(esi):457[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.89-8.85(m,1h),8.39(s,1h),8.35-8.19(m,1h),6.86(dd,j＝16.6,10.6hz,0.5h),6.76(dd,j＝16.6,10.3hz,0.5h),6.13(t,j＝15.7hz,1h),5.70(d,j＝12.4hz,0.5h),5.58(d,j＝10.4hz,0.5h),4.71(d,j＝6.7hz,1h),4.64(d,j＝11.3hz,0.5h),4.46(d,j＝12.9hz,0.5h),4.36(s,2h),4.22-4.10(m,2h),4.03(s,2h),3.09(s,3h),3.02(t,j＝12.8hz,0.5h),2.87(t,j＝11.5hz,0.5h),2.65
–
2.56(m,1h),1.93
–
1.81(m,3h),1.52-1.38(m,1h),1.08(s,6h).
[0301]
实施例68 6-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)(乙基)氨基)-7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶3(2h)-酮(g-68)的制备
[0302][0303]
化合物g-68的制备方法同化合物g-60。ms m/z(esi):413.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.71(s,1h),8.24(s,1h),8.01(s,1h),6.67(dd,j＝16.7,10.5hz,1h),6.09(d,j＝16.9hz,1h),5.58(d,j＝10.4hz,1h),4.32(s,2h),4.23(d,j＝12.6hz,3h),3.85(s,3h),3.41(q,j＝7.0hz,2h),3.19(t,j＝11.6hz,1h),3.01(s,1h),1.98
–
1.87(m,1h),1.82(d,j＝10.3hz,2h),1.71
–
1.59(m,1h),1.14(t,j＝7.0hz,3h).
[0304]
实施例70 6-((1-丙烯酰基哌-3-基)(甲基)氨基)-7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基氨基)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶3(2h)-酮(g-70)的制备
[0305][0306]
步骤1：化合物:70-1的制备方法同化合物2-2，不同的是将化合物2-2制法中化合物2-1与化合物2.2换成化合物60-1与化合物59.1。ms m/z(esi):610[m h]

。
[0307]
步骤2至步骤3同实施例60中步骤3与步骤4。最后经prep-hplc纯化得化合物g-70(7mg,产率20％)。ms m/z(esi):414.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.31
–
8.21(m,1h),8.18(s,1h),7.86
–
7.76(m,1h),7.52(d,j＝3.7hz,1h),6.79(ddd,j＝28.5,16.5,10.3hz,1h),6.65-6.55(m,1h),6.14
–
5.92(m,2h),5.66(s,1h),5.55-5.45(m,1h),4.51
–
4.40(m,1h),4.32(d,j＝6.9hz,2h),4.05(dd,j＝37.3,13.7hz,3h),3.70(d,j＝4.2hz,3h),3.05
–
2.91(m,3h),2.87(d,j＝15.2hz,1h),1.74(dd,j＝65.5,13.3hz,4h),1.43(s,1h).
[0308]
实施例71 6-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-7-氟-4-(4-吗啉代)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-71)的制备
1.52(m,1h),1.27-1.16(m,1h).
[0317]
实施例74 6-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)(乙基)氨基)-7-氟-4-(4-吗啉代)-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-3(2h)-酮(g-74)的制备
[0318][0319]
化合物g-74的制备方法同化合物g-73。ms m/z(esi):509.3[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.44-8.37(m,1h),8.21(s,1h),7.41-7.37(m,2h),6.91
–
6.72(m,2.5h),6.66
–
6.49(m,0.5h),6.11(d,j＝17.3hz,0.5h),5.96(d,j＝17.3hz,0.5h),5.68(d,j＝10.9hz,0.5h),5.47(d,j＝10.9hz,0.5h),4.52
–
4.24(m,4h),3.99(dd,j＝34.1,12.4hz,1h),3.69(s,4h),3.50(s,3h),2.96(s,4h),2.83(t,j＝11.6hz,1h),1.80(s,3h),1.37(s,1h),1.13(t,j＝6.8hz,3h).
[0320]
实施例75 2-((1-丙烯酰基哌啶-3-基)(甲基)氨基)-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基氨基)-6,7-二氢-5h-吡咯并[3,4-d]嘧啶-5-酮(g-75)的制备
[0321][0322]
化合物g-75的制备方法中步骤1至步骤5同化合物g-59中步骤2至步骤6。ms m/z(esi):397.2[m h]

。
[0323]
实施例76化合物g-76的制备
[0324][0325]
化合物g-76的制备方法中步骤1至步骤4同化合物g-2中步骤1至步骤4。ms m/z(esi):412[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.27(s,1h),8.07(s,1h),7.87(s,1h),7.60(s,1h),6.54(dd,j＝16.8,10.3hz,1h),6.09(dd,j＝16.8,2.4hz,1h),5.63(dd,j＝10.3,2.3hz,1h),4.29(s,2h),3.93
–
3.85(m,2h),3.81(dd,j＝10.7,7.6hz,1h),3.76(s,3h),3.66(dd,j＝12.6,7.5hz,1h),3.57
–
3.51(m,3h),3.35(dd,j＝12.8,4.9hz,1h),3.08
–
3.02(m,1h),2.98
–
2.92(m,1h).
[0326]
实施例77化合物g-77的制备
[0327][0328]
步骤1的制备方法同化合物2-1，不同的是将化合物2-1制法中化合物2.1换成化合物77.1。ms m/z(esi):561[m h]

。
[0329]
步骤2至步骤4同化合物g-7中步骤1至步骤3。ms m/z(esi):411.3[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.79(s,1h),8.31(d,j＝7.9hz,2h),6.59(ddd,j＝16.8,13.7,10.3hz,1h),6.14(ddd,j＝16.8,6.4,2.4hz,1h),5.66(ddd,j＝14.6,10.3,2.4hz,1h),4.34(s,2h),3.88(s,3h),3.84
–
3.74(m,2h),3.72
–
3.42(m,6h),2.06
–
1.86(m,4h).
[0330]
实施例78n-(1-(7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-基)哌啶-3-基)丙烯酰胺(g-78)的制备
[0331][0332]
化合物g-78的制备方法同化合物g-77。ms m/z(esi):385.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.89(s,1h),8.44(s,1h),8.40(s,1h),8.10-8.14(m,1h),6.25(dd,j1＝10.0hz,j2＝17.2hz,1h),6.12(dd,j1＝2.0hz,j2＝17.2hz,1h),5.60(dd,j1＝2.0hz,j2＝10.0hz,1h),4.37(s,2h),4.12-4.20(m,1h),3.90-4.01(m,2h),3.89(s,3h),3.15-3.28(m,1h),2.95-3.06(m,1h),1.76-1.96(m,2h),1.48-1.63(m,2h).
[0333]
实施例79化合物g-79的制备
[0334][0335]
化合物g-79的制备方法同化合物g-77。ms m/z(esi):411.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.93(s,0.5h),8.78(s,0.5h),8.50(s,0.5h),8.34-8.24(m,1.5h),6.84-6.78(m,0.5h),6.45-6.41(m,0.5h),6.18-6.12(m,1h),5.69-5.47(m,1h),4.80-4.76(m,1.5h),4.32(s,2h),4.23-4.20(m,1h),4.02-3.98(m,0.5h),4.00-3.96(m,4h),3.67-3.52(m,2h),2.79-2.63(m,0.5h),2.13-1.6(m,4h).
[0336]
实施例80化合物g-80的制备
[0337][0338]
化合物g-80的制备方法同化合物g-77。ms m/z(esi):371.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.79(s,1h),8.42(d,j＝6.4hz,1h),8.31(s,2h),6.27
–
6.20(m,1h),6.16
–
6.09(m,1h),5.61(dd,j＝9.9,2.2hz,1h),4.42(s,1h),4.36(s,2h),3.88(m,4h),3.79(m,2h),3.60(d,j＝11.1hz,1h),2.20
–
2.14(m,1h),1.92(d,j＝5.7hz,1h).
[0339]
实施例81化合物g-81的制备
[0340][0341]
化合物g-81的制备方法同化合物g-77。ms m/z(esi):425.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.79(s,1h),8.29(s,2h),6.80(ddd,j＝39.1,16.5,10.8hz,1h),6.08(d,j＝16.0hz,1h),5.62(dd,j＝41.7,11.1hz,1h),4.34(s,2h),3.88(s,3h),3.77(s,2h),3.60(d,j＝5.6hz,2h),3.49(d,j＝3.7hz,2h),3.37(d,j＝12.4hz,2h),1.82(s,1h),1.78
–
1.63(m,3h),1.58(s,2h).
[0342]
实施例82n-(1-(7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-基)哌啶-3-基)丙烯酰胺(g-82)的制备
[0343][0344]
化合物g-82的制备方法同化合物g-76。ms m/z(esi):400.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.30(s,1h),8.24(s,1h),8.14(d,j＝7.6hz,1h),7.89(d,j＝0.7hz,1h),7.53(d,j＝0.7hz,1h),6.23(dd,j＝17.1,10.1hz,1h),6.07(dd,j＝17.1,2.3hz,1h),5.57(dd,j＝10.1,2.3hz,1h),4.32(s,2h),4.14(dd,j＝12.6,3.9hz,1h),3.95
–
3.79(m,2h),3.73(s,3h),3.15
–
3.04(m,1h),2.91(dd,j＝12.6,9.5hz,1h),1.90(dd,j＝12.6,4.2hz,1h),1.84
–
1.75(m,1h),1.58(d,j＝11.4hz,1h),1.48(ddd,j＝21.1,12.2,8.8hz,2h).
[0345]
实施例83n-(1-(7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-基)吡咯烷-3-基)丙烯酰胺(g-83)的制备
[0346][0347]
化合物g-83的制备方法同化合物g-76。ms m/z(esi):386.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.38(d,j＝6.5hz,1h),8.28(s,1h),8.09(s,1h),7.88(d,j＝0.7hz,1h),7.62(d,j＝0.7hz,1h),6.20(dd,j＝17.1,10.0hz,1h),6.08(dd,j＝17.1,2.4hz,1h),5.56(dd,j＝9.9,2.4hz,1h),4.41
–
4.33(m,1h),4.30(s,2h),3.76(s,4h),3.58
–
3.50(m,1h),2.13(dt,j＝13.8,6.9hz,1h),3.26(s,1h),1.89(dq,j＝12.1,6.2hz,1h).
[0348]
实施例84化合物g-84的制备
[0349][0350]
化合物g-84的制备方法同化合物g-76。ms m/z(esi):412.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.29(d,j＝10.1hz,1h),8.12(s,1h),7.86(d,j＝1.9hz,1h),7.58(d,j＝9.8hz,1h),6.48(m,1h),6.05(m,1h),5.59(m,1h),4.67(d,j＝30.3hz,1h),4.38
–
4.27(m,2h),3.86
–
3.70(m,5h),3.69
–
3.44(m,3h),3.36(m,1h),3.15
–
2.92(m,1h),2.12
–
1.97(m,1h),1.92
–
1.73(m,1h).
[0351]
实施例85n-(1-(7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-基)氮杂环丁烷-3-基)丙烯酰胺(g-85)的制备
[0352][0353]
化合物g-85的制备方法同化合物g-76。ms m/z(esi):372.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.77(d,j＝7.1hz,1h),8.37(s,1h),8.14(s,1h),7.91(s,1h),7.59(s,1h),6.14(qd,j＝17.1,6.1hz,2h),5.62(dd,j＝9.7,2.5hz,1h),4.70(dd,j＝12.9,5.6hz,1h),4.45(t,j＝7.5hz,2h),4.32(s,2h),4.07
–
3.93(m,2h),3.76(s,3h).
[0354]
实施例86n-(4-氟-1-(7-氟-4-(4-吗啉代)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-基)吡咯烷吡啶-3-基)丙烯酰胺(g-86)的制备
[0355][0356]
化合物g-86的制备方法同化合物g-76。ms m/z(esi):485.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.53(s,1h),8.44(d,j＝6.6hz,2h),8.21(s,1h),7.55(d,j＝9.0hz,2h),6.89(d,j＝9.1hz,2h),6.15
–
6.12(m,1h),5.61(m,1h),5.19(s,0.5h),5.07(s,0.5h),4.50
–
4.40(m,1h),4.35(s,2h),4.02
–
3.64(m,9h),3.05
–
2.96(m,4h).
[0357]
实施例87化合物g-87的制备
[0358][0359]
化合物g-87的制备方法同化合物g-76。ms m/z(esi):412.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.27(s,1h),8.07(s,1h),7.87(s,1h),7.60(s,1h),6.54(dd,j＝16.8,10.3hz,1h),6.09(dd,j＝16.8,2.4hz,1h),5.63(dd,j＝10.3,2.4hz,1h),4.29(s,2h),3.92
–
3.87(m,2h),3.81(dd,j＝10.7,7.6hz,1h),3.76(s,3h),3.66(dd,j＝12.8,7.6hz,1h),3.57
–
3.51(m,3h),3.35(dd,j＝12.8,5.0hz,1h),3.07
–
3.02(m,1h),2.97
–
2.92(m,1h).
[0360]
实施例88n-(1-(7-氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基氨基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶-6-基)吡咯烷-3-基)-n-甲基丙烯酰胺(g-88)的制备
[0361][0362]
化合物g-88的制备方法同化合物g-76。ms m/z(esi):400.2[m h]

。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.28(s,1h),8.08(s,1h),7.86(s,1h),7.61(s,1h),6.88-6.73(m,1h),6.10(d,j＝17.0hz,1h),5.66(d,j＝10.6hz,1h),5.09(s,1h),4.79(s,1h),4.30(s,2h),3.86-3.79(m,2h),3.75(s,3h),3.70
–
3.51(m,2h),2.97-2.81(m,2h),2.10(s,2h).
[0363]
实施例89至实施例102
[0364]
化合物g-89至g-102可参照上述实施例中的方法进行制备。
[0365]
[0366]
[0367]
[0368][0369]
[0370]
[0371]
[0372]
[0373][0374]
生物测试
[0375]
测试例一lantha screening激酶反应实验方法
[0376]
化合物预先溶解在100％dmso中。室温溶解10mm的药物储存液，经8vol％dmso溶液梯度稀释至终浓度10-0.005μm。384孔板(corning 3676)每孔中加入2.5μl的待测物溶液以及2.5μl经反应缓冲液稀释的激酶(invitrogen pv3363)，再加入5μl的反应缓冲液稀释
fluososcei-polygt(invitrogen pv3610)底物与atp(invitrogen pv3227)的混合物启动反应。其中空白孔(blank)用反应缓冲液代替激酶，激酶孔(enzyme)不加入任何药物。在25℃摇床避光反应60分钟后。加入10μl detection solution(invitrogen pv3528与edta的混合液，用tr-fret稀释缓冲液进行稀释，edta工作浓度为5mm，lanthascreening tb py20 antibody工作浓度为0.2nm)，于室温摇床反应30分钟。在victorx5荧光酶标仪(perkinelmer)上读板，测定激发波长为340nm、发射波长为500nm和520nm的光吸收。
[0377]
抑制率计算方法(参照invitrogen，pv3363的说明书)如下：
[0378]
1.emission rate(er):coumarin emission(520nm)/fluorescein emission(500nm)
[0379]
2.抑制率(ir):(er
kinase-er
test compound
)/(er
kinase-er
blank
)
×
100％。用xlfit 5.0软件(英国idbs公司)拟合计算半数抑制浓度ic50。结果如表1所示：
[0380]
表1化合物对btk wt的抑制活性
[0381][0382]
测试例二 细胞内βbtk y223磷酸化检测htrf实验方法
[0383]
化合物预先溶解在100％dmso中。室温溶解10mm的药物储存液，经5vol％dmso溶液梯度稀释至终浓度3-0.0014μm。将ramos细胞以4
×
105/孔的密度种到96孔板中，每孔45μl含10％(v/v)fbs的1640培养基，每孔中加入5μl的稀释好的待测物溶液，37℃、5％(v/v)co2培养1小时。加入10μl过钒酸钠稀释液(无血清的1640稀释)，阴性对照孔加入10μl无血清培
养基，25℃摇床孵育30分钟。每孔加入20μl裂解液(4x裂解液：封闭母液25:1)，25℃摇床孵育30分钟。振荡器800rpm震荡1分钟，取16μl细胞裂解液加入384孔板(greiner 784075)中，加入4μl预先混合的抗体溶液(phospho-btk d2抗体和phospho-btk cryptate抗体使用检测液稀释20倍)，25℃摇床孵育过夜。在victorx5荧光酶标仪(perkinelmer)上读板，测定激发波长为317nm、发射波长为500nm和520nm的光吸收(参照cisbio，63adk017peh的说明书)。用xlfit 5.0软件(英国idbs公司)拟合计算半数抑制浓度ic50。结果如表2所示：
[0384]
表2化合物对βbtk y223细胞的抑制活性
[0385][0386]
从表1和表2可以看出，本发明代表性化合物对酶和细胞具有较高的抑制活性。
[0387]
测试例三对野生型egfr激酶的活性抑制测试
[0388]
以下z-lyte测试方法中所用试剂均可购自invitrogen。
[0389]
利用z-lyte方法测定待测物对野生型egfr激酶(invitrogen，pv3872)的抑制活性。
[0390]
10ul野生型egfr激酶反应体系中各组分的工作浓度为：10μm atp，0.8ng/μl野生型egfr激酶(invitrogen，pv3872)，2μm tyr04底物(invitrogen，pv3193)。加入待测物后dmso的终浓度为2％。
[0391]
室温溶解10mm的药物储存液经4％dmso的水梯度稀释至终浓度10-0.005μm。每孔中加入2.5μl的待测物溶液以及5μl经反应缓冲液稀释的野生型egfr激酶与tyr04底物的混合物，再加入2.5μl的atp启动反应。其中c1孔用反应缓冲液代替atp，c2孔不加入任何药物，c3孔按说明书描述加入磷酸化的底物。在25度摇床避光反应60分钟后。加入5μldevelopment reagent b(invitrogen，用tr-fret稀释缓冲液进行稀释)，于室温摇床反应60分钟。在victorx5荧光酶标仪(perkinelmer)上读板，测定激发波长为405nm、发射波长为450nm和520nm的光吸收(例如，c3
520nm
表示c3孔在520nm的读值)。
[0392]
抑制率计算方法(参照invitrogen，pv3193的说明书)如下：
[0393]
1、er＝coumarin emission(450nm)/fluorescein emission(520nm)
[0394]
2、磷酸化率＝(1-((er
×
c3
520nm-c3
450nm
)/((c1
450nm-c3
450nm
) er
×
(c3
520nm-c1
520nm
))))
×
100％
[0395]
3、抑制率(ir)＝(1-(测试化合物的磷酸化率)/(c2的磷酸化率))
×
100％
2min，超声1-2min，溶液呈澄清透明状态。
[0405]
分析方法：采用液相色谱-串联质谱法(型号：triple quad
tm 4000)分析血浆样品。
[0406]
标曲的配制：配制待测化合物在icr小鼠血浆基质中线性范围为1.00-3000ng/ml的标准曲线，同时配制浓度为3，500，2400ng/ml的低中高浓度的质控样品。
[0407]
生物样品的处理：将冻存的血浆样品放置冰上解冻，待样品解冻后，放置涡旋仪上涡旋5min。取20μl血浆样品加至96孔板中，再加入200μl含内标地塞米松(品牌：nifdc，批号:1n2v-dpgy，配制浓度2000ng/ml)的乙腈(品牌：默克，批号：1854029643)沉淀蛋白，涡旋混合5min，然后在3700rpm，4℃离心15min，提取上清同样条件下二次离心，最后2μl上清溶液进lc-ms/ms分析。本发明部分实施例化合物在相同给药方式下，小鼠体内的药代动力学性质参数如表4所示：
[0408]
表4化合物在小鼠体内药代动力学参数
[0409][0410]
na表示为测试。
[0411]
从表4可以看出，本发明示例化合物的药代吸收好，具有明显的药代吸收效果，同时表现出良好的生物利用度。研究发现，当与哌啶环连接的氮原子上有取代基时(如甲基)，化合物在小鼠体内的药效与未有取代基时相比，有明显的下降(如化合物g-7和g-60，化合物g-14和g-71，化合物g-23和g-72)。
[0412]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。