一种藜麦CqALS基因突变体及分子鉴定方法和应用与流程

一种藜麦cqals基因突变体及分子鉴定方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种藜麦cqals基因突变体及分子鉴定方法和应用。


背景技术：

2.藜麦(chenopodium quinoa willd)，属于藜科，双子叶，4倍体，一年生草本，联合国粮农组织(fao)将2013年定名为国际藜麦年，向全球推广藜麦。2020年全球已有100多个国家在做藜麦的种植试验或商业化生产，但藜麦生产中遇到最大的难题之一是藜麦生长中伴生的诸多杂草，如灰菜、油菜等尚没有登记的除草剂可以使用难以寻找到合适的方式除去，国内(在中国)主要通过人工锄草的方式解决杂草的问题，这样的结果是生产成本每公顷的人力成本增加4500万人民币(以2021年生产成本算)，除成本增加外，在藜麦集中生产区，常常在锄草季节有劳动力不足的风险，藜麦规模生产中的杂草处理成为了重要的限制因素，生产成本的增加，消费端形成了影响。
3.乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)即als，存在于植物生长过程中，它能以高度专一性和极高的催化效率催化丙酮酸为乙酰乳酸，从而导致支链氨基酸的生物合成。目前市面上的除草剂成分大部分为als抑制剂，通过抑制als而破坏植物体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成，但是als抑制剂的使用不仅对杂草有效，同时对藜麦也有杀灭作用。
4.开发和培育能够抗除草剂的藜麦品种成为解决藜麦规模化生产的关键，同时也是降低生产成本的最有效直接的途径。
5.本发明使用ems诱变的方式对藜麦种子基因组实现点突变，寻找到可以对als抑制剂类除草剂具备抗性的藜麦cqals基因突变体，提供了一种藜麦cqals基因突变体及分子鉴定方法和应用。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供具备抗除草剂性能的藜麦材料。
7.为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
8.一种藜麦cqals基因突变体的构建方式，包括如下步骤：
9.s1.制备1.5mg/ml浓度的ems；
10.s2.选取种子颗粒直径在2.5mm以上，色泽为乳白色，适合高原生长的藜麦种子，使其浸泡于1.5mg/ml浓度的ems中溶液中15min。
11.s3.将处理好的藜麦种子及时在温室中采用育苗盘播种育苗，幼苗长到6片叶后在准备好的大田进行移栽，移栽密度为行距40cm，株距20cm，后期按正常藜麦种植进行管理，成熟后收获其单株种子记为二代种子。
12.s4.二代种子播种于穴盘中，盘尺寸为长宽高(30cm
×
60cm
×
5cm)，培育至长出4片
叶后喷5倍推荐使用浓度的甲氧咪草烟(imazamox)除草剂als类除草剂，浓度为(23mg/m2)，观察记录每天变化，每天进行正常管理，15天后标记存活的单株，20天选择不受除草剂影响的单株移栽到育苗盆(尺寸)，培养至种子成熟，单株收获种子(第三代种子)。
13.s5.二代结的种子成熟后，收取单株种子记为三代种子，使用三代种子进行筛选具备抗目标除草剂的藜麦基因型；
14.s6.鉴定cqals基因突变体。
15.一种藜麦cqals基因突变体，所述藜麦cqals基因突变体cqals-5为藜麦cqals2-1基因发生点突变后形成的具有抗除草剂功能的突变体。
16.所述藜麦变体构建时使用的种子为山西农谷稼祺种业有限公司种子库中的稼祺505材料的种子(此材料属于高原品种，种子颗粒白且大)。
17.所述藜麦cqals基因突变体突变位置为藜麦cqals基因的核苷酸序列上第1609位的g突变为t。
18.所述突变为藜麦cqals-5的基因是cqals2-1，由于藜麦为四倍体，cqals基因其存在cqals1-1、cqals1-2、cqals2-1以及cqals2-2共四个不同的cqals基因，本发明中发生突变的为cqals2-1，其核苷酸序列为seq id no:1。
19.所述藜麦cqals基因突变体藜麦cqals-5的基因核苷酸序列为seq id no:2，为seq id no:1序列经过第1609位的g突变为t得到的突变序列。
20.所述藜麦cqals-5所形成的氨基酸序列为seq id no:3。
21.所述藜麦cqals-5突变体的获得方式为ems诱变。
22.本发明还提供了一种藜麦cqals基因突变体的分子鉴定方法，包括鉴定藜麦cqals-5突变体。
23.所述鉴定藜麦cqals-5突变体所用的方式为：提取藜麦单株dna后，设计引物进行扩增，判断藜麦单株突变情况。
24.所述鉴定藜麦cqals-5突变体所用的引物序列为seq id no:4-5。
25.本发明还提供了一种藜麦cqals基因突变体的应用，包括藜麦cqals-5突变株在基于cqals基因突变中的应用和藜麦cqals-5突变株在在抗除草剂中的应用两部分。
26.所述藜麦cqals-5突变株在基于cqals基因突变中的应用，该应用是在使用上述种子中的上述cqals基因突变中的应用。
27.所述藜麦cqals-5突变株在在抗除草剂中的应用，该应用是在使用上述种子中的抗除草剂中的应用。
28.所述藜麦cqals-5突变株在在抗除草剂中的应用，该应用是在使用上述种子中的抗普施特除草剂中的应用。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
30.本发明使用ems诱变的方式对藜麦种子基因组实现点突变，寻找到可以对cqals抑制剂类除草剂特别是als类除草剂具备抗性的藜麦cqals基因突变体，提供了一种具备抗普施特除草剂性能的藜麦材料，通过选择优良株系培育抗除草剂品种，解决了藜麦的规模化问题，也为未来的藜麦杂交抗除草剂品种提供了骨干自交系。可通过使用除草剂解决藜麦生产中的伴生杂草可大大降低藜麦的生产成本。
附图说明
31.图1为本发明实施例中cqals2-1基因突变体的鉴定图；
32.图2为正常cqals2-1基因结构图；
33.图3为cqals2-1基因突变后的基因结构图；
34.图4为藜麦cqals基因突变体株与正常藜麦株在普施特除草剂的作用下的存活量；
35.图5为藜麦cqals2-1基因突变体株的测序结果；
36.图6为藜麦cqals2-1基因突变体株中突变基因在ncbi中的比对结果图；
37.图7为藜麦cqals2-1基因突变株中基因突变位点示意图。
具体实施方式
38.以下本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
39.实施例
40.本发明的具体实施例中，提供一种藜麦cqals基因突变体的具体构建方法，所述构建方法如下：
41.制备1.5mg/ml浓度的ems，选取种子颗粒直径在2.5mm以上，色泽为乳白色，适合高原生长的藜麦种子，使其浸泡于1.5mg/ml浓度的ems中溶液中15min，将处理好的藜麦种子(此时该种子记为m1代种子)播种在准备好的育苗盘中(基质为:育苗专用基质)，播种密度为每盘1000粒种子，待幼苗长到6片真叶进行大田移栽，移栽密度为行距40cm，株距20cm，按藜麦生长要求进行大田施肥、锄草、浇水等正常管理直到藜麦成熟将每株藜麦进行编号，收获的单株装入纱网袋，人工脱粒，处理干净，晾晒水分至12％时放入种子库记为m2代种子，将每个收获的单株混合300粒左右m2代种子建立突变体混池用于抗除草剂als除草剂试验，继续在温室穴盘播种混合好的突变体种子，每穴盘600-1000粒，播种量为200万粒。出苗后浇水，病虫害防治正常管理，4片叶后喷除草剂普施特，原液配置浓度为5x，(使用背负式喷雾器均匀喷雾)，喷药后的第15天选取强壮的幼苗单株移入20cm口径育苗盘，在温室中培育直到藜麦成熟将每株藜麦进行编号并收获单株种子记为m3代种子。将收获的单株种子进行cqals基因突变的藜麦基因型鉴定，dna提取并通过特定引物上游引物,下游引物：进行pcr，结果为阳性的种子，再进行cqals基因突变的纯杂合鉴定，dna提取并通过特定引物：进行pcr，结果为阳性的种子即为稳定的且具备抗除草剂性能藜麦材料。
42.本发明的又一个具体实施例中，所述cqals基因突变的筛选具体为：
43.使用m2代种子建立突变体混池用于抗除草剂als除草剂试验，继续在温室穴盘播种混合好的突变体种子，每穴盘600-1000粒，播种量为200万粒。出苗后浇水，病虫害防治正常管理，4片叶后喷除草剂普施特，普施特的具体药筛浓度为16g/亩，施药时间为一天一次，共15天。需要说明的是，再正常的藜麦生产过程中，普施特的具体药筛浓度为3.2g/亩。
44.本发明的又一个具体实施例中，所述cqals基因突变的藜麦基因型鉴定具体为：
45.对ems处理并经过除草剂als除草剂药物筛选后的种株进行dna提取并用特异性引物进行扩增，筛选cqals基因突变体，其中针对cqals2-1基因突变基因设计的引物序列为：f:5
′‑
cattactcctcaatatgacccta-3
′
r:5
′‑
tcttcttgctcaccctttc-3
′
(seq id no:4-5)。得到一种藜麦cqals基因藜麦cqals-5突变体，其特征在于，所述突变位置为藜麦cqals2-1基
因的核苷酸序列上第1609位的g突变为t，核苷酸序列为seq id no:2。
46.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选使用实例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。