KRT15在食管癌辅助诊断和靶向治疗中的用途

krt15在食管癌辅助诊断和靶向治疗中的用途
技术领域
1.本发明涉及食管癌的诊断和治疗的领域。具体地，本发明涉及krt15在食管癌辅助诊断和靶向治疗中的用途。


背景技术：

2.krt15(keratin 15，ck15/k15)属于角蛋白家族，是一种中间纤维蛋白，负责维持上皮细胞的结构完整性(omary et al.,2004)。目前已发现多种角蛋白，根据它们等电点和序列不同可被分为ⅰ型角蛋白和ⅱ型角蛋白：ⅰ型角蛋白为酸性蛋白，分子量在40-55kda，包括k9-k28、k31-k40；ⅱ型角蛋白为中性或碱性蛋白质，分子量在56-70kda，包括k1-k8、k71-k86。通常两种类型的角蛋白会配对表达，二者专性非共价结合为异聚体即i/ii型复合物，聚合在一起形成特征性的10nm宽的丝状排列(schweizer et al.,2006)。不同器官的上皮细胞中存在特定类型的角蛋白表达，角蛋白的异常表达与肿瘤的发生也密切相关，适用于癌症的诊断、分型和预后判断，比如，k5/k14和k1/k10分别存在于基底细胞和角质形成细胞中；ⅱ型k7或k8与ⅰ型k18/k19/k20/k23形成的角蛋白组合则表达于消化器官上皮组织的单层细胞中；k8和k18是成人肝细胞中仅有的角蛋白，而胆管细胞中角蛋白表达类型为k7/k19和k8/k18(omary et al.,2009)。
3.krt15特异性地表达于上皮组织的基底细胞层，比较特殊的是，目前并未明确与krt15配对表达的ⅱ型角蛋白(waseem et al.,1999)。根据uniport国际蛋白数据库的最新信息，在被收录的人体多种器官的组织中，krt15在食管粘膜中表达最高。多项研究表明，krt15阳性细胞可能具有干细胞样的特性，帮助细胞维持自我更新能力，促进上皮细胞再生：yang等体外成功将人诱导多功能干细胞(ipscs)改造成一种上皮干细胞(epscs)，这种再生细胞中含有krt15阳性的干细胞群(yang et al.,2014)；giroux等利用体内遗传谱系追踪技术在小鼠食管中发现了一类具有干细胞特性的长寿祖细胞群，这群细胞特征性地表达krt15，并且krt15阴性的基底细胞群与阳性细胞群在表达谱上有着显著的差异，缺失krt15后会引起食管上皮的萎缩(giroux et al.,2017)；他们还利用小鼠模型和3d器官培养技术研究了小肠的krt15对放射敏感性的影响，发现小肠腺窝中krt15阳性细胞对高剂量的放射非常耐受，有助于细胞修复放射引起的上皮损伤(giroux et al.,2018)。krt15的表达与细胞的分化程度密切相关，其表达下调对维持细胞的角化状态非常重要(waseem et al.,1999)，因此krt15在一些上皮干细胞来源的肿瘤中存在高表达，比如毛囊干细胞来源的毛上皮瘤(jih et al.,1999)、肺鳞状细胞癌(gomez-morales et al.,2013；sanchez-palencia et al.,2011)、乳腺癌(chong et al.,2012)、尿路上皮癌(tai et al.,2013)等。此外，利用krt15的表达情况还可以将肿瘤分成多个亚型：krt15在肺鳞状细胞癌中特异性地膜浆阳性表达，可以将其与肺腺癌区分(gomez-morales et al.,2013；sanchez-palencia et al.,2011)；folgueira等研究了ⅱ期和iii期乳腺癌的基因表达谱，发现与正常组织相比，krt15在ⅱ期与iii期乳腺癌患者中的表达存在明显差异(folgueira et al.,2006)；krt15联合tcn1、hoxb13有助于分辨交界性和恶性乳腺癌，提高乳腺癌诊断的准确性
(chong et al.,2012)；还有研究者利用不同的分化相关分子将成釉细胞瘤分为多个亚型，他们提出癌巢内krt15阳性的基底细胞类似于口腔上皮或齿叶细胞，krt15阴性的基底细胞与外釉上皮细胞比较相似(pal et al.,2013)。腺样囊性癌(acc)的预后主要与原发性肿瘤的位置有关，皮肤来源的肿瘤预后较好，但泪腺、唾液腺来源的预后较差。有研究显示，krt15在皮肤原发的和唾液腺原发的accs中的表达有明显的差异，可以用于明确肿瘤来源，进而判断患者预后(north et al.,2015)。cd133

细胞可能参与肝癌的发生过程，zekri等分析了肝癌患者和正常人群中的此类细胞，发现krt15是唯一在肝癌患者cd133

细胞中高表达的基因(zekri et al.,2017)。由此可见，krt15与上皮来源的肿瘤发生密切相关，在临床诊断、预后判断以及肿瘤分型方面都有着很好的应用前景。基于目前尚无文献报道krt15在食管癌细胞中的作用机制。


技术实现要素：

4.本发明人意想不到地发现，krt15在不同食管癌患者之间的表达差异较大，krt15表达与淋巴结转移和分化程度显著相关，并且显著影响患者的总生存时间；另一方面，敲降krt15的表达后，可显著抑制食管癌细胞的增殖，抑制或降低小鼠中食管癌的肿瘤生长。
5.基于以上的意想不到的发现，本发明在第一方面提供了一种用于检测krt15表达水平的检测剂在制备用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂中的用途。
6.在优选的实施方案中，本发明所述的krt15表达水平是指krt15基因表达水平，包括但不限于krt15 mrna表达水平，和/或krt15蛋白表达水平。
7.在本发明优选的实施方案中，可以使用krt15表达水平的检测剂测定食管癌患者的样品中krt15表达水平；通过与参考样品中的krt15表达水平相比较，判断所述食管癌患者的肿瘤分化程度、发生淋巴结转移的风险和/或预后生存时间。
8.另一方面，本发明提供了用于检测krt15表达水平的检测剂在制备用于评估食管癌患者治疗效果的试剂中的用途。与治疗前的患者样本中的krt15表达水平相比，krt15表达水平降低，表明治疗有效。
9.在本发明优选的实施方案中，检测krt15基因表达水平的检测剂包括但不限于特异性结合krt15基因的引物和/或探针。
10.可以使用本领域技术人员公知的任何方法检测krt15基因的表达水平，这样的方法包括但不限于：northern blot、聚合酶链式反应、逆转录酶pcr、定量实时pcr、纳米阵列、微阵列、放射自显影或原位杂交。
11.尤其是，可以用实时定量rt-pcr(qrt-pcr)。在一些实施方案中，qrt-pcr可以被用于对krt15 mrna进行检测和定量。qrt-pcr是本领域技术人员熟知的且容易获得的技术，且不需要详细的说明。例如可以使用商品化可获得的基于qrt-pcr的方法(如阵列)，基于本领域公知的krt15的序列，很容易设计引物和/或探针。
12.在本发明优选的实施方案中，检测krt15蛋白表达水平的检测剂包括但不限于特异性结合krt15蛋白的抗体。
13.可以使用本领域技术人员公知的任何方法检测krt15蛋白的表达水平，这样的方法包括但不限于：western blot、免疫印迹、elisa、质谱法。
14.在另一方面中，本发明提供了靶向krt15的试剂在制备治疗食管癌的药物中的用
途，其中所述靶向krt15的试剂抑制和/或降低krt15基因和/或蛋白的表达水平、或拮抗krt15蛋白的功能。
15.在本发明优选的实施方案中，抑制和/或降低krt15基因表达水平的试剂是核酸。
16.在一个更具体的实施方案中，所述抑制和/或降低krt15基因表达水平的试剂是与krt15基因序列互补的反义核酸分子，优选为krt15基因反向互补的单链rna分子，其可特异性结合和抑制内源性krt15基因。
17.在本发明优选的实施方案中，抑制和/或降低krt15蛋白表达水平是通过用干扰rna敲降krt15蛋白的表达水平。当在体内引入时，干扰rna与其他蛋白质形成rna诱导沉默复合物(“risc”)并启动称为rna干扰(rnai)的过程。在rnai过程中，risc合并单链干扰rna或双链干扰rna的一条链。并入的链充当risc识别互补的mrna转录物的模板。一旦确定互补mrna，risc中的蛋白质组分激活并切割mrna，导致靶基因表达的敲降。用于敲降靶基因表达的干扰rna分子的非限制性实例包括sirna、短发夹rna(shrna)、单链干扰rna和微rna(mirna)。使用这些干扰rna的方法是本领域技术人员公知的。
18.在本发明具体的实施方案中，通过使用krt15蛋白质的拮抗剂拮抗krt15蛋白质的功能，用于治疗食管癌，所述krt15蛋白质的拮抗剂为特异性结合并阻断krt15蛋白质功能的拮抗剂抗体。
19.在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中食管癌的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抑制和/或降低krt15基因和/或蛋白的表达水平、或拮抗krt15蛋白的功能的试剂。
20.另一方面，本发明提供了体外筛选抗食管癌试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
21.1)体外培养食管癌细胞株；
22.2)使待检测试剂与1)中培养的食管癌细胞接触，和
23.3)检测食管癌细胞株中krt15基因和/或蛋白的表达水平，
24.如果与接触待检测试剂之前相比，krt15基因和/或蛋白的表达水平显著降低，则所述待检测试剂可用于治疗食管癌。
25.在进一步优选的实施方案中，根据本发明的体外筛选抗食管癌试剂的方法所述食管癌细胞选自kyse150、kse450和kyse510；优选地，所述待检测试剂选自抑制和/或降低krt15基因和/或蛋白的表达水平、或拮抗krt15蛋白的功能的干扰rna和拮抗抗体。本领域技术人员可以根据本领域的公知常识选择这些干扰rna和拮抗抗体。
26.术语
27.除非本文有具体说明，否则本文中使用的术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
28.如本文所使用的，krt15的基因cds序列包括但不限于nm_002275.4中所示的序列：
[0029][0030]
krt15蛋白的氨基酸序列，例如，如np_002266.3所示:
[0031][0032][0033]
如本文所述的“样品”，可以为源自食管癌患者的任何生物样品，其中包含核酸和/蛋白质。这种样品的实例包含液体(包含血液、血浆、血清、尿液、精液)、组织、细胞样品、器官、活检样品、肿瘤样品等。优选地，样品为组织、细胞的活检样品，更优选地，样品为活检的食管癌组织样品。样品可以根据常规的技术进行收集，并直接用于诊断或贮存。肿瘤样品可以是新鲜的、冷冻的或者石蜡包埋的。通常地，可用的肿瘤样品是冷冻的或者石蜡包埋的，大多数时候是石蜡包埋的。
[0034]
如本文所述的“参考样品”，可以为源自对照的样品，所述对照为健康受试者或者可以为已知具有或不具有淋巴结转移的食管癌患者，所述参考样品包括但不限于，包含液体(包含血液、血浆、血清、尿液、精液)、组织、细胞样品、器官、活检样品、肿瘤样品等。优选地，样品为组织、细胞的活检样品，更优选地，样品为活检的食管癌组织样品。优选地，参考样品池包含源自至少一名(优选地为数名，更优选地为至少5名，更优选地至少6名，至少7名，至少8名，至少9名，至少10名)对照的样品。
[0035]
本文中所用的术语“引物”指的是与模板杂交并用于引发与目标互补的多核苷酸的聚合的短多核苷酸，通常具有游离的3’oh基团。
[0036]
本文中所用的术语“探针”指的是在基于杂交的试验中，用于检测与探针互补的多核苷酸序列的短多核苷酸，探针可以由在此限定的多核苷酸的“片段”组成。
[0037]
本文中的术语“抗体”按最广义使用，指包含两个重链和两个轻链的任何免疫球蛋白(ig)分子，以及其任何片段、突变体、变体或衍生物，只要该片段、突变体、变体或衍生物表现出所需要的生物学活性(例如，表位结合活性)。
[0038]
如本文所用，“抑制”和/或“降低”krt15的表达水平，指与施用所述“抑制”和/或“降低”试剂之前的参考水平相比，krt15表达水平降低至少10％，例如降低至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或多至且包括100％的降低(即与参考样品相比不存在的水平)，或与参考水平相比在10-100％之间的任何降低；优选地，所述参考水平，可以指施用本发明的试剂治疗前的水平。
[0039]
术语“治疗”或“处理”包括在受试者如人中治疗本文所述的疾病或病症，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发生；(ii)缓解疾病或病症，即引起病症消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。
[0040]
如本文所用，术语“敲降”是指与不包含减少表达的遗传修饰的对应对照细胞中靶mrna或相应蛋白质的表达相比，遗传修饰细胞中靶mrna或相应蛋白质表达的可测量的降低。本领域技术人员将容易理解如何使用各种遗传方法，例如sirna、shrna、mirna、反义rna或其他rna介导的抑制技术，以基于本文所述细节敲降靶多核苷酸序列或其部分。
[0041]
术语“干扰rna”是指rna核酸分子，其是双链或单链的，并且能够实现针对敲降靶基因表达的rna干扰机制的诱导。
[0042]
如本文所用的术语，“sirna”是双链rna，其长度通常小于30个核苷酸。通过sirna的基因沉默开始于sirna的一条链并入称为rna诱导沉默复合物(risc)的核糖核蛋白复合物中。并入risc中的链识别与并入的sirna链至少部分互补的mrna分子，且然后risc切割这些靶mrna或抑制其翻译。
[0043]
术语“mirna”是小的非编码rna分子，其可以与mrna分子内的互补序列杂交，从而导致mrna的切割，或通过缩短其聚(a)尾巴使mrna不稳定。
[0044]
术语“单链干扰rna”可以与双链sirna类似的方式实现mrna沉默，尽管效率低于双链sirna。单链干扰rna通常具有约19至约49个核苷酸的长度。
[0045]
术语“短发夹rna或小发夹rna(shrna)”是具有紧密发夹转角的人工rna分子，其可用于通过其在细胞中产生的sirna沉默靶基因表达。shrna在细胞中的表达通常通过质粒载体或通过病毒或细菌载体实现。合适的载体包括但不限于腺相关病毒(aav)、腺病毒和慢病毒。shrna是sirna的有利介质，因为它具有相对低的降解和转换率。
[0046]
术语“拮抗剂抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括抑制或降低该抗体所结合的抗原(例如，krt15)的生物活性的抗体。因此，krt15拮抗剂抗体涵盖结合krt15并且以任何有意义的程度(包括显著地)阻断、抑制、抵消、拮抗、降低krt15激动剂活性的抗体。
[0047]
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且无论是体外还是原位，是指可适用于本文所述的方法的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。
[0048]
术语“治疗”或“处理”包括在受试者如人中治疗本文所述的疾病或病症，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发生；(ii)缓解疾病或病症，即引起病症消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。
[0049]
术语“施用”或“给予”治疗剂如降低krt15表达的试剂包括引入或递送治疗剂以执行预期功能的任何途径。可以通过适合于递送药剂的任何途径进行施用。因此，递送途径可包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下递送。在一些实施方案中降低krt15表达的试剂直接施用于肿瘤，例如，通过注射到肿瘤中。
[0050]
以下将结合附图以及具体实施例进一步说明本发明的实施方案，但是，不应理解为将本发明的范围限于这些具体实施例。
附图说明
[0051]
图1.食管癌组织中krt15的rna原位杂交(rish)结果代表图。
[0052]
图2.krt15表达与食管癌患者临床病理参数的相关性分析结果。图下的数值代表两组之间比较的显著性差异p值。g1：高分化，g2：中分化，g3：低分化；n0：无淋巴结转移；n1：淋巴结转移。
[0053]
图3.食管癌根治术病例krt15的rna表达与患者总生存期的kaplan-meier生存分析图。
[0054]
图4.食管癌组织中krt15的免疫组织化学结果代表图。
[0055]
图5.敲降krt15显著抑制食管癌细胞的增殖能力。左：kyse150、kyse450、kyse510细胞中分别瞬时转染两种特异性针对krt15的sirna后，按照1000个/孔的数量接种于96孔板，cck-8法检测细胞活力，绘制0-5天的生长曲线。error bar表示mean
±
sd(n＝3，***p《0.001)。右：western blot检测转染sirna后，krt15的敲降效果。
[0056]
图6a至图6b.敲降krt15促进食管癌细胞发生g2/m期阻滞。分别在kyse150、kyse510细胞中转染krt15特异性sirna，48小时后收集细胞，经pi染色后利用流式细胞术分析细胞的周期分布情况。左侧为周期分布的峰图，右侧为柱形统计图。
[0057]
图7.敲降krt15显著抑制食管癌细胞裸鼠皮下成瘤能力。稳定表达non-silencing-shrna和krt15-shrna的kyse150细胞系皮下接种于裸鼠右侧腋下，饲养21天后，断颈法处死裸鼠，剖取瘤组织并拍照称重，绘制瘤体积的生长曲线和瘤重散点图。error bar表示mean
±
sd(n＝6，***p《0.001)。
[0058]
图8.人受体酪氨酸激酶(rtk)磷酸化抗体芯片检测结果。分别在kyse150、kyse510细胞中转染krt15特异性sirna，48小时后收集细胞并提取蛋白，利用aah-prtk-1试剂盒检测71个受体酪氨酸激酶的磷酸化水平的变化。a，磷酸化抗体阵列的排列，两个并排的点是每种抗体的重复。b，aah-prtk-1芯片检测结果原始图，pos1/2、neg为内参。
[0059]
图9.敲降krt15后的下游分子改变。分别在kyse150、kyse510细胞中转染krt15特异性sirna，48小时后收集细胞并提取蛋白，western blot检测p-epha3、epha3、p-egfr、egfr、p-akt、akt、以及p-erk、erk的表达情况，gapdh为内参。
[0060]
图10.sds-page结合考马斯亮蓝染色结果。
[0061]
图11.krt15相互作用蛋白基因富集分析结果。
[0062]
图12.在食管癌细胞中krt15与egfr存在相互作用。
具体实施方式
[0063]
实施例1 krt15在患者食管癌组织中的表达
[0064]
我们利用rna原位杂交技术分析krt15在食管癌组织中的表达情况，以及与患者的预后关系。选取来自2011-2015在河南省林州食管癌医院收集的1013例食管癌术后组织样品(术前未经任何治疗)，进行rna原位杂交分析。具体步骤参见以下材料和方法部分。
[0065]
结果发现，krt15在不同食管癌患者之间的表达差异较大，在43.93％(445/1013)的食管癌组织中高表达(强度
×
面积的评分均值在3分以上)，38.60％(391/1013)的食管癌组织中不表达(强度
×
面积的评分均值为0分)(图1)。临床病理参数的相关性分析结果显示，krt15表达与食管癌患者淋巴结转移和分化程度相关(图2)。kaplan-meier生存分析显示，krt15阳性表达的病例总生存时间显著较短(p＝0.0044，图3)。
[0066]
我们进一步利用免疫组织化学技术检测krt15在食管癌及其手术切缘组织中的表达情况(图4)，具体步骤参见以下材料和方法部分。相关性分析结果证明，krt15在蛋白水平的表达与rna水平具有显著相关性(见以下表1)。
[0067]
表1.krt15 rna和蛋白表达的相关性分析
[0068][0069]
实施例2 krt15对食管癌细胞增殖能力的影响
[0070]
为了探讨krt15促进食管癌发展的机制，我们检测了krt15对食管癌细胞恶性表型的影响。在krt15高表达的食管癌细胞系kyse150、kyse450、kyse510中分别瞬时转染两种特异性针对krt15的sirna，对照包括亲本组或转染非沉默组。待细胞完全贴壁时，使用cck-8法检测细胞活力。结果表明，敲降krt15后，食管癌细胞的增殖能力比对照组明显降低(图5)。
[0071]
实施例3 krt15对食管癌细胞周期分布的影响
[0072]
利用流式细胞术分析细胞周期中g0/g1、g2和s期细胞的比例，结果显示敲降krt15促进食管癌细胞发生g2/m期阻滞(图6a至图6b)。
[0073]
实施例4 krt15对食管癌细胞裸鼠成瘤能力的影响
[0074]
将构建好的plko.1-krt15-shrna和plko.1-非沉默shrna载体，包装至慢病毒载体上，进一步通过慢病毒感染途径筛选获得稳定表达非沉默shrna和krt15-shrna的kyse150细胞系。裸鼠皮下移植瘤成瘤实验结果显示，相比于对照组，krt15-shrna组皮下瘤生长速度明显较慢，皮下瘤重量较轻，具有显著差异(p《0.001)(图7)。
[0075]
实施例5 krt15在食管癌中的作用机制研究
[0076]
在kyse150和kyse450食管癌细胞中瞬时敲降krt15，培养48小时后，收取细胞沉淀并提取蛋白，利用raybiotech公司的aah-prtk-1试剂盒检测改变krt15表达之后，71个受体酪氨酸激酶的磷酸化水平的变化。芯片扫描得到的原始数据经raybiotech软件进行背景去除、芯片间归一化处理，获得可用于分析的normalization 1without background数据。采用fold change(表达差异倍数)对差异蛋白进行分析(以每个分组平均荧光信号值》150，并
且变化≤0.83或者变化≥1.2为条件)，结果显示敲降krt15后，kyse150细胞中ack1、btk、alk、epha3的磷酸化水平降低，ret、matk、egfr、jak1、pyk2、epha5、tnk1、hgfr、fer、fyn、fgfr2、hck、dtk、m-csfr、jak2、ephb4、epha6的磷酸化水平升高；敲降krt15后，kyse450细胞中lck、ngfr、alk、ror2、jak2、btk、epha3、igf-i r、epha1、ret、ephb1、erbb3、axl的磷酸化水平降低，epha6、dtk、ephb3、fer、frk、matk、ros、vegfr2、fak、jak1、pdgfr-β、lyn、tnk1、scfr、tie-2、egfr的磷酸化水平升高(图8的a)。我们优先选取kyse150和kyse450细胞中变化一致的蛋白进行验证，发现krt15可以正向调控epha3的磷酸化水平，但负向调控egfr的磷酸化。基于受体酪氨酸激酶主要通过pi3k-akt通路和mapk通路调控肿瘤细胞的增殖与分化，我们重点检测了akt和erk的活化状态，结果显示敲降krt15后，p-akt显著下调，而p-erk并无明显改变(图9)。
[0077]
我们利用gst pull-down实验联合质谱分析与krt15相互作用的蛋白。gst与krt15-gst融合蛋白分别与食管癌细胞kyse150的蛋白裂解液、gst琼脂糖珠进行孵育并经蛋白电泳分离，考马斯亮蓝染色结果显示实验组与对照组之间存在差异条带，将高丰度蛋白与低丰度蛋白分别切取进行质谱分析(图10)。质谱所获数据利用proteome discoverer 1.4软件进行相应的数据库检索，最后获得901个蛋白质，其中264个蛋白为krt15-gst实验组特异检出蛋白。
[0078]
我们针对所得的差异蛋白进行了基因富集分析，结果显示与krt15存在相互作用的蛋白主要涉及dna代谢过程(图11)，包括egfr、msh2、ddx11、mlh1、dkc1、cct8、stoml2、nek7、pcna、exosc6、rac1，其中egfr、pcna、rac1被报道参与肿瘤的发生发展过程。我们利用co-ip结合western blot实验检测免疫沉淀复合物中krt15与egfr的表达情况，结果提示krt15与egfr在同一复合物中(图12)。
[0079]
材料与方法
[0080]
1、免疫组织化学相关实验
[0081]
(1)组织芯片制备
[0082]
1)标记切片：镜下阅读he切片，使用记号笔在肿瘤组织切片上标记至少3个癌巢清晰的位置，同样在与其配对的正常的组织切片上标记2-3个形态学正常位置。
[0083]
2)标记蜡块：比对同一病例的he切片和石蜡包埋的蜡块，根据病例he切片上的标记，在对应的石蜡块上使用记号笔标记待取材的位置点。
[0084]
3)制作受体蜡块：在65℃条件下融化普通病理石蜡，经3次沉淀后，加入3％的精制蜂蜡，制作成大小合适的受体蜡块。
[0085]
4)制作组织微阵列：根据设计组织微阵列的排布，选取合适孔径的打孔针。水浴锅温度设定为65℃，石蜡融化后置于模具之中。选取合适的空白受体蜡块，按照预先设定的坐标位置点在空白蜡块上进行打孔，并弃去空白芯。然后在组织蜡块的目标位置点进行打孔取材，并移入在受体蜡块上打好的针孔内。阵列完成后，使用融化好的液体石蜡封闭暴露的组织。
[0086]
5)切片：将制备好的组织微阵列蜡块置于4℃冰箱放置30分钟，然后切取4μm厚度的白片，并贴于阳离子防脱片上，65℃干燥箱中过夜。
[0087]
(2)免疫组织化学实验
[0088]
1)脱蜡：使用鼓风式烘箱68℃，15rpm转速下烘烤组织芯片2小时，使石蜡融尽，然
后迅速放入二甲苯溶液中，脱蜡15分钟，重复3次。
[0089]
2)水化：将脱蜡后的组织芯片依次浸入100％、80％、70％的乙醇中各5分钟，进行梯度水化。
[0090]
3)清洗：将组织芯片依次浸入pbst溶液、pbs缓冲液ⅰ、ⅱ、ⅲ中，每次清洗5分钟。
[0091]
4)抗原修复：抗原修复盒中装满枸橼酸钠缓冲液(ph＝6.0)或edta修复液(ph＝8.0/ph＝9.0)，微波炉高火预热3分钟。将组织芯片转移至预热的修复液中，微波炉中低火加热20分钟，然后自然冷却到室温。
[0092]
5)封闭内源性过氧化物酶：避光配置3％过氧化氢，然后滴加于组织芯片上，避光封闭15分钟。
[0093]
6)清洗：将组织芯片依次浸入pbst溶液、pbs缓冲液ⅰ、ⅱ、ⅲ中，每次清洗5分钟。
[0094]
7)一抗孵育：使用石蜡笔勾勒组织芯片边缘，一抗稀释液稀释抗体，将抗体稀释轻柔地滴加于组织表面，使其完全覆盖组织，置于装有水的湿盒中4℃孵育过夜。
[0095]
8)清洗：将组织芯片依次浸入pbst溶液、pbs缓冲液ⅰ、ⅱ、ⅲ中，每次清洗5分钟。
[0096]
9)pv9000两步法检测i：滴加pv9000检测试剂盒中的试剂i(polymer helper)于组织芯片，使其完全覆盖组织，将玻片置于湿盒中37℃孵育20分钟。
[0097]
10)清洗：将组织芯片依次浸入pbst溶液、pbs缓冲液ⅰ、ⅱ、ⅲ中，每次清洗5分钟。
[0098]
11)pv9000两步法检测ii：滴加pv9000检测试剂盒中的试剂ii(polyperoxidase-anti-mouse/rabbit igg)于组织芯片，使其完全覆盖组织，将玻片置于湿盒中37℃孵育30分钟。
[0099]
12)清洗：将组织芯片依次浸入pbst溶液、pbs缓冲液ⅰ、ⅱ、ⅲ中，每次清洗5分钟。
[0100]
13)dab显色：配置dab染色液，滴加于组织表面，使其完全覆盖组织，镜下观察显色效果，当组织内部着色后立即去除dab溶液并放于蒸馏水中。
[0101]
14)复染：滴加苏木素染液至组织表面，15秒左右后流水冲洗。
[0102]
15)返蓝：将芯片置于1％氨水中反应8-10分钟，使组织充分返蓝。
[0103]
16)脱水：将组织芯片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各5分钟，进行梯度脱水。
[0104]
17)透明：将组织芯片浸入二甲苯洗缸中，透明10分钟，重复2次，然后置于通风橱中晾干。
[0105]
18)封片：滴加中性封片剂于组织芯片，盖上盖玻片进行封片。
[0106]
19)镜下观察，使用nano zoomer数字化病理切片扫描仪扫描组织芯片，针对各样品进行评分。
[0107]
(3)评分原则
[0108]
1)病例排除原则：组织阵列中同一病例的全部或超过一半发生脱片；组织中无癌巢、或无正常上皮组织；癌巢中的肿瘤细胞数量少于100个；癌巢中肿瘤细胞发生空泡化及皱缩；组织脱水。
[0109]
2)评分标准：首先确定蛋白定位(细胞核、细胞浆、细胞膜)，明确阳性信号，分别根据阳性信号的强度和阳性信号的面积进行评分，强度设定0、1、2、3四个等级，面积设定1、2、3三个等级：
[0110]
强度评分面积评分不着色：0分《20％：1分
低倍镜下信号不可见，高倍镜下呈淡黄色：1分≥20％：2分低倍镜下信号可见，高倍镜下呈棕黄色：2分≥50％：3分低倍镜下信号可见，高倍镜下呈深褐色：3分 [0111]
每个点的得分为强度
×
面积的得分，每个病例的最后得分按多个点的平均值计算，0分的病例定义该蛋白表达阴性，≥3分的病例定义为表达阳性。
[0112]
2、rna原位杂交技术(advanced cell diagnostics 2.5hd可见光棕色检测试剂盒)
[0113]
(1)石蜡标本预处理：
[0114]
1)脱蜡：使用鼓风式烘箱68℃，15rpm转速下烘烤组织芯片2小时，使石蜡融尽，然后迅速放入二甲苯溶液中，脱蜡10分钟，重复3次。
[0115]
2)水化：将脱蜡后的组织芯片浸入100％乙醇中，2分钟/次，共两次，然后室温风干。
[0116]
3)封闭内源性过氧化物酶：滴加5-8滴双氧水于组织芯片上，室温反应10分钟，然后放入蒸馏水中清洗两次，每次3分钟。
[0117]
4)处理靶标修复试剂：配置1x靶标修复液，置于微波炉中煮沸，然后将组织芯片缓慢放入煮沸的修复液中，修复15分钟。
[0118]
5)清洗：将组织芯片立即放入蒸馏水中清洗两次，每次3分钟，然后依次浸入75％、85％、100％、100％乙醇中各2分钟，室温条件下彻底风干。
[0119]
6)rnascope蛋白酶处理：每张组织芯片上滴加约3滴蛋白酶plus，盖上塑料膜，40℃条件下孵育30分钟，然后使用蒸馏水清洗两次，每次3分钟。
[0120]
(2)rnascope探针杂交及放大处理
[0121]
1)预处理：将洗涤缓冲液稀释至1x，置于40℃水浴备用；将探针置于40℃水浴中处理10分钟，然后冷却至室温；将amp 1-6避光放置在冰盒上，备用。
[0122]
2)杂交：轻弹载玻片，去除过量液体，加入4滴左右的探针，使其完全覆盖组织，放入湿盒中，置于40℃温箱中孵育2小时。
[0123]
3)清洗：取出杂交后的玻片，洗涤缓冲液清洗2次，每次2分钟。
[0124]
(3)放大
[0125]
1)杂交amp1(40℃30分钟)：轻弹载玻片，去除过量液体，加入约35μl amp 1，使其完全覆盖每个组织，盖上塑料膜后放入湿盒内，40℃条件下处理30分钟，去除过量液体，然后将载玻片放入40ml 1
×
洗涤缓冲液摇洗2次，每次2分钟。
[0126]
2)杂交amp2(40℃15分钟)：轻弹载玻片，去除过量液体，加入约45μl amp 2，使其完全覆盖每个组织，盖上塑料膜后放入湿盒内，40℃条件下处理15分钟，去除过量液体，然后将载玻片放入40ml 1
×
洗涤缓冲液摇洗2次，每次2分钟。
[0127]
3)杂交amp3(40℃30分钟)：轻弹载玻片，去除过量液体，加入约35μl amp 3，使其完全覆盖每个组织，盖上塑料膜后放入湿盒内，40℃条件下处理30分钟，去除过量液体，然后将载玻片放入40ml 1
×
洗涤缓冲液摇洗2次，每次2分钟。
[0128]
4)杂交amp4(40℃15分钟)：轻弹载玻片，去除过量液体，加入约45μl amp 4，使其完全覆盖每个组织，盖上塑料膜后放入湿盒内，40℃条件下处理15分钟，去除过量液体，然后将载玻片放入40ml 1
×
洗涤缓冲液摇洗2次，每次2分钟。
[0129]
5)杂交amp5(室温，最好延长到1h)：轻弹载玻片，去除过量液体，加入约45μl amp5，使其完全覆盖每个组织，盖上塑料膜后放入湿盒内，40℃条件下处理40分钟-1小时，去除过量液体，然后将载玻片放入40ml 1
×
洗涤缓冲液摇洗2次，每次2分钟。
[0130]
6)杂交amp6(室温15分钟)：轻弹载玻片，去除过量液体，加入约35μl amp6，使其完全覆盖每个组织，盖上塑料膜后放入湿盒内，40℃条件下处理15分钟，去除过量液体，然后将载玻片放入40ml 1
×
洗涤缓冲液摇洗2次，每次2分钟。
[0131]
(4)检测信号
[0132]
1)dab显色：将dab-a溶液和dab-b溶液等体积混合，配制dab染色液，向每个组织切片上滴加约60μl dab溶液，盖上塑料膜，然后在室温下温育10分钟。
[0133]
2)清洗：用蒸馏水清洗两次，每次5分钟。
[0134]
3)复染：滴加苏木素染液至组织表面，1分钟左右后流水冲洗。
[0135]
4)返蓝：将芯片置于40-50℃左右的热水中约5分钟，使组织充分返蓝。
[0136]
5)脱水：将组织芯片浸入100％乙醇中2分钟进行脱水，重复两次。
[0137]
6)透明：将组织芯片浸入二甲苯洗缸中，透明30分钟，重复两次，然后置于通风橱中晾干。
[0138]
7)封片：滴加中性封片剂于组织芯片，盖上盖玻片进行封片。
[0139]
8)镜下观察，使用芯片扫描仪扫描结果，针对各样品进行评分。
[0140]
(5)评分原则
[0141]
1)镜下观察组织：评估组织和细胞形态学特征；评估阳性对照信号的强度，阳性信号为细胞内的可见小斑点；确定阴性对照背景。
[0142]
2)评分标准：分别根据阳性信号的强度和阳性信号的面积进行评分，强度设定0、1、2、3四个等级，面积设定1、2、3三个等级：
[0143]
强度评分面积评分染色点为0或少于1个信号点/10个细胞：0分《20％：1分40倍镜下可见0-3个信号点/细胞：1分≥20％：2分40倍镜下可见4-10个信号点/细胞：2分≥50％：3分40倍镜下可见》10个信号点/细胞：3分 [0144]
每个点的得分为强度
×
面积的得分，每个病例的最后得分按多个点的平均值计算，0分的病例定义该蛋白表达阴性，≥3分的病例定义为表达阳性。
[0145]
3、细胞总rna提取(康为世纪rnapure tissue&cell kit cw0560)
[0146]
1)细胞生长至70-90％汇合度时，弃原培养基，pbs清洗两遍，使用胰酶消化细胞，培养基终止消化后1000rpm离心3分钟，收集细胞沉淀。
[0147]
2)每5
×
10
6-1
×
107的细胞数加入600μl缓冲液rl，反复吹打几次后使其充分裂解，然后室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
[0148]
3)12,000rpm离心2-5分钟，收取上清。
[0149]
4)加入1倍体积的70％乙醇(无rnase水配制)，混匀。
[0150]
5)将以上所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，可按两次分别转入，12,000rpm离心1分钟，弃掉收集管中的废液后将其放回收集管中。
[0151]
6)吸取350μl缓冲液rw1溶液加入至吸附柱中，12,000rpm离心15秒，弃废液后将吸附柱放回收集管中。
[0152]
7)配制dnase i混合液：52μl rnase-free water中加入8μl 10
×
反应缓冲液以及20μl dnase i(1u/μl)，混匀后配制成终体积为80μl的反应液。
[0153]
8)吸取80μl配制好的dnase i反应液加入至吸附柱中，在20-30℃条件下孵育15分钟。
[0154]
9)吸取350μl缓冲液rw1溶液加入至吸附柱中，12,000rpm离心15秒，弃废液后将吸附柱重新放回收集管中。
[0155]
10)向吸附柱中加入500μl已加入缓冲液rw2溶液(含无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，弃收集管中的废液，然后将吸附柱放回收集管中。
[0156]
11)重复以上步骤。
[0157]
12)12,000rpm条件下离心2分钟后，弃收集管中的废液。然后将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱。
[0158]
13)将吸附柱置于新的无rnase离心管中，悬空加入30-50μl无rnase水于吸附柱中央，室温放置1分钟，然后12,000rpm条件下离心1分钟，收集rna溶液。
[0159]
14)使用nanodrop软件测定rna浓度，a260/280比值大于2.0视为合格，-70℃保存rna，防止降解。
[0160]
4、逆转录(康为世纪hifiscript gdna removal rt mastermix cw2020)
[0161]
1)不含rnase水、rt缓冲液、dntp混合液、dtt、rna模板、引物混合液、hifiscript置于冰上备用。
[0162]
如下配制反应体系：
[0163][0164]
2)涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
[0165]
3)cdna合成反应条件：
[0166]
42℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
30-50分钟
[0167]
85℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5分钟
[0168]
10℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
∞
[0169]
4)反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
[0170]
5)逆转录产物可直接用于pcr反应和荧光定量pcr反应，或置于-20℃长期保存。
[0171]
5、目的基因扩增(takara hs dna聚合酶r010)
[0172]
1)针对krt15-cds全长的引物设计
[0173]
转录本：nm_002275.3
[0174]
正向引物：ccggaattctaatgaccaccacatttctgcaaaac(seq id no：3)
[0175]
反向引物：cccaagcttttagatttctctcttgtgggaagaaacc(seq id no：4)
[0176]
2)如下配制pcr反应体系(50μl)：
[0177][0178]
3)如下设置pcr反应程序：
[0179][0180]
4)根据pcr产物片段大小配制相应浓度的琼脂糖凝胶，电泳检测pcr产物。
[0181]
6、目的基因pcr产物回收与纯化
[0182]
1)pcr产物加入6
×
loading buffer，琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物。
[0183]
2)在凝胶成像仪下切取目的基因的特异条带，并称量胶块重量。
[0184]
3)根据胶块重量，按照1μl/mg的比例加入binding缓冲液，65℃金属浴10分钟至胶块充分溶解。
[0185]
4)将以上所得溶液全部转入吸附柱中，静置1分钟后，12,000rpm离心1分钟，弃过滤液。
[0186]
5)加入700μl washing缓冲液，12,000rpm离心1分钟，弃过滤液。
[0187]
6)重复以上步骤。
[0188]
7)室温放置3分钟，12,000rpm离心2分钟，使酒精完全挥发。
[0189]
8)取出吸附柱，放入新的1.5ml ep管中，垂直向吸附柱中央加入50μl rnaase free water，静置10分钟后13,000rpm离心2分钟，收集dna溶液。
[0190]
9)测定浓度后，用于后续酶切反应或-20℃保存。
[0191]
7、载体与目的基因双酶切
[0192]
1)如下配制双酶切体系(50μl)：
[0193]
10
×
buffer(根据酶切组合选择)5μl质粒dna或krt15-cdsxμl限制性内切酶11μl(1μg dna对应1μl限制性内切酶)限制性内切酶21μl(1μg dna对应1μl限制性内切酶)ddh2o至50μl
[0194]
2)37℃酶切2小时，琼脂糖电泳检测双酶切效果，回收并纯化质粒dna和目的基因
片段，测定dna浓度。
[0195]
8、载体与目的基因连接
[0196]
1)将回收获得的质粒dna和krt15-cds片段按照摩尔质量比1：3-1：5进行混合，总体积为5μl，加入等体积的溶液ⅰ。
[0197]
2)16℃连接4小时或过夜。
[0198]
9、细菌转化
[0199]
1)取8μl连接产物加入至50μl冰上融化的dh5α感受态细胞中，混匀。
[0200]
2)冰上放置30分钟，42℃热激45秒，迅速置于冰上2分钟。
[0201]
3)向感受态细胞中加入600μl不含抗生素的lb培养基，置于37℃恒温摇床中，190rpm转速下培养60分钟。
[0202]
4)取出400μl菌液，使用涂布器均匀涂抹在含有抗生素的lb平板上，待菌液被吸收完全后，于37℃敷箱倒置过夜培养12-16小时。
[0203]
5)挑取单克隆进行菌液pcr鉴定。
[0204]
10、菌液pcr鉴定
[0205]
1)挑取5个单菌落于1ml含抗生素的lb培养基中，37℃恒温，220rpm条件下培养过夜。
[0206]
2)吸取200μl菌液，12,000rpm离心1分钟，弃上清。
[0207]
3)加入50μl无核酸酶水，98℃煮沸5分钟，吸取上清，获得质粒dna。
[0208]
4)如下配制菌液pcr体系(20μl)：
[0209][0210][0211]
5)如下设置pcr反应程序：
[0212][0213]
6)根据pcr产物片段大小配制相应浓度的琼脂糖凝胶，电泳鉴定pcr产物。
[0214]
7)吸取200μl pcr鉴定结果为阳性的菌液送公司进行测序鉴定。
[0215]
8)测序鉴定成功的菌液加入20％的甘油进行保种，-80℃保存。
[0216]
11、质粒提取(康为世纪endofree plasmid midi kit cw2105)
[0217]
1)5-15ml过夜培养的菌液转移至10ml离心管中，4℃3,000rpm离心15分钟，弃上清。
[0218]
2)1ml 1
×
pbs重悬菌体沉淀，转移至1.5ml离心管中，13,000rpm离心1分钟，小心弃掉全部上清，收集菌体沉淀。
[0219]
3)加入500μl缓冲液p1溶液(含rnase a)重悬菌体沉淀。
[0220]
4)向离心管中加入500μl缓冲液p2溶液，温和地上下颠倒混匀8-10次，充分裂解菌体，然后室温放置3-5分钟。
[0221]
5)向离心管中加入500μl缓冲液e3溶液，立即上下颠倒混匀8-10次，室温放置5分钟。13,000rpm离心5分钟后吸取上清。
[0222]
6)将上清加入过滤柱中，13,000rpm离心1分钟，然后将收集管中的滤液转移到离心管中。
[0223]
7)加入450μl异丙醇于收集获得的滤液中，上下颠倒混匀。
[0224]
8)柱平衡：向吸附柱(含收集管)中加入200μl缓冲液ps溶液，13,000rpm离心2分钟，弃废液后将吸附柱重新放回收集管中。
[0225]
9)将步骤7的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中。
[0226]
10)13,000rpm离心1分钟，弃收集管中的废液，然后将吸附柱重新放回收集管中。
[0227]
11)加入750μl缓冲液pw溶液(已加入无水乙醇)于吸附柱中，13,000rpm离心1分钟后弃收集管中的废液。
[0228]
12)将吸附柱重新放回收集管中，13,000rpm离心1分钟。
[0229]
13)将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，吸取100-200μl endo-free缓冲液eb悬空加入吸附膜的中间部位，室温放置15分钟后13,000rpm离心2分钟。
[0230]
14)重复步骤12)，获得质粒dna，并测定质粒浓度，-20℃保存。
[0231]
12、plko-shkrt15慢病毒载体构建相关实验
[0232]
(1)设计shkrt15寡核苷酸
[0233]
正向寡核苷酸：
[0234]5’
[0235]
ccgggaagccgaagtatctcagcttctcgagaagctgagatcttcggcttc-tttttg 3
’ꢀ
(seq id no：5)；
[0236]
反向寡核苷酸：
[0237]5’
[0238]
aattcaaaaagaagccgaagtatctcagcttctcgagaagctgagatcttcggcttc 3
’ꢀ
(seq id no：6)。
[0239]
(2)shrna寡核苷酸退火
[0240]
1)新合成的shrna寡核苷酸12,000rpm，离心10min，以防开盖后洒出。
[0241]
2)使用无核酸酶水稀释寡核苷酸至20μmol/l。
[0242]
3)如下配制退火体系(50μl)：
[0243][0244]
4)如下设置反应程序进行梯度降温，使寡核苷酸退火：
[0245][0246]
(3)酶切plko.1载体并回收纯化
[0247]
1)如下配制双酶切体系(50μl)：
[0248][0249]
2)37℃酶切2小时，琼脂糖电泳检测双酶切效果，回收并纯化质粒dna，测定dna浓度。
[0250]
(4)连接
[0251]
1)如下配制连接体系：
[0252]
退火的寡核苷酸
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3μl
[0253]
酶切载体
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
xμl(50ng)
[0254]
溶液
ⅰꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3 xμl
[0255]
2)16℃连接4小时或过夜。
[0256]
3)取部分连接产物转化transstble 3感受态细胞，挑单克隆，经测序鉴定正确后提取质粒。
[0257]
13、western blot实验
[0258]
(1)细胞蛋白提取
[0259]
1)细胞生长至80-90％汇合度时，弃原培养基，1
×
pbs清洗两遍，用细胞铲小心刮取细胞，加入适量1
×
pbs溶液收集细胞，1,000rpm离心3min，弃上清，获得细胞沉淀。
[0260]
2)加入适量有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的ripa裂解液，冰上裂解30分钟。
[0261]
3)12,000rpm，4℃离心20分钟，小心吸取蛋白上清至新的1.5ml ep中，分装置于-80℃保存。
[0262]
(2)bca蛋白定量(thermofisher bca protein assay kit 23227)
[0263]
1)配制bca工作液：按照regent a:regent b＝50:1的比例配制工作液，充分混匀。
[0264]
2)配制蛋白标准品：使用蛋白裂解液梯度稀释标准品bsa储存液，设置浓度为0μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl、1μg/μl、2μg/μl。
[0265]
3)分别取1μl标准品或待检测样品加入96孔板中，每孔加入99μl bca工作液，轻微震荡充分混匀，37℃孵育30分钟。
[0266]
4)使用酶标仪测量在570nm波长下的吸光度值。
[0267]
5)根据bsa标准品的吸光度值，绘制标准曲线。依据标准曲线和样品的吸光度值计算待检测样品的蛋白浓度。
[0268]
(3)sds-page电泳和蛋白印迹
[0269]
1)制胶：架好洗净并晾干的玻璃板，依据目的蛋白分子量配制相应浓度的sds-page分离胶，轻柔地灌入玻璃板中，然后加入millipore超纯水进行水封，室温静置1小时，待分离胶与水之间出现一条平整的界线，去除水层，并用滤纸吸干。配制5％浓缩胶，轻柔地加入分离胶上层，并插入样梳。室温静置1小时，浓缩胶凝固后，将凝胶玻璃组装至电泳槽，注入电泳缓冲液，静置5分钟观察是否出现漏液，然后小心地拔出梳子，使用电泳缓冲液反复冲洗上样孔，准备上样。
[0270]
2)电泳：取相同质量的蛋白样品，加入5
×
蛋白上样缓冲液，混匀，100℃变性10分钟，冰上冷却后瞬时离心，小心地将样品加入至样孔中。电泳条件：80v，30分钟；100v，电泳至溴酚蓝到达距玻璃板下沿5mm处。
[0271]
3)蛋白质印迹：电泳结束后，使用楔形工具将凝胶取出，浸泡于转膜缓冲液中。将pvdf膜和whatman 3m滤纸裁剪至5.2cm
×
8.4cm大小，pvdf膜先后经甲醇浸泡5秒，超纯水浸泡5分钟，然后转入转膜缓冲液。待滤纸、pvdf膜、凝胶均在转膜缓冲液中浸泡10分钟后，依照阳极到阴极的顺序摆放海绵、滤纸、pvdf膜、分离胶、滤纸，海绵，然后放入加有转膜缓冲液的转膜槽中，在冰水浴中以220ma恒流转膜2小时。
[0272]
4)目的蛋白封闭与抗体孵育：转膜结束后，迅速取出pvdf膜，置于封闭液中(5％脱脂牛奶)封闭1小时；按说明书比例使用封闭液配制目的蛋白抗体稀释液，抗原抗体4℃杂交过夜；回收一抗，洗膜缓冲液tbst漂洗目的条带，每次6分钟，洗涤4次；加入与一抗来源种属对应的二抗稀释液，室温孵育1小时；tbst漂洗目的条带4次，每次6分钟。所用抗体如下：krt15(abcam ab52816)、p-epha3(y527)(abcam ab191565)、epha3(santa sc514209)、p-akt(s473)(cst 4060)、akt(cst 4691)、p-erk1/2(y202/t204)(cst 4370)、erk1/2(cst 4695)、p-egfr(y1068)(cst 3777)、egfr(proteintech18986-1-ap)。
[0273]
5)目的蛋白的检测：将超敏发光液ecl的a液与b液等体积混合，均匀地滴加在pvdf膜上，然后使用las4000曝光机进行曝光显影。
[0274]
6)目的蛋白的洗脱：曝光结束后，将目的蛋白条带置于洗脱液中，摇床上洗脱30分钟，然后tbst漂洗3次，每次10分钟，封闭后即可孵育新的一抗，进行下一轮的目的蛋白检测。
[0275]
14、gst pull-down相关实验
[0276]
(1)gst融合目的蛋白的表达及纯化
[0277]
1)空载pgex-kg和质粒pgex
–
kg-krt15转化感受态细胞bl21(de3)。
[0278]
2)转化后的bl21(de3)细菌接种至含有氨苄青霉素的lb培养基中，置于37℃，220rpm的摇床中过夜培养。
[0279]
3)将菌液接种至100ml lb培养基(含氨苄青霉素)中，37℃，220rpm继续培养直至菌液的od值为0.6左右，然后加入1mmol/l iptg，在25℃，180rpm条件下诱导表达8小时。
[0280]
4)将菌液转移至无菌的50ml离心管，4℃，3,000rpm离心10分钟，去上清获得菌体沉淀，1
×
pbs清洗两次，根据菌体沉淀量加入适量的含1％triton-100的pbst，并按比例加入蛋白酶抑制剂和溶菌酶，冰上超声至溶液清透(超声条件：80w，工作10秒，间歇15秒)。
[0281]
5)低温条件下，12,000rpm离心20分钟，收集上清获得蛋白。
[0282]
6)sds-page凝胶电泳结合考马斯亮蓝染色，检测融合蛋白是否成功表达。
[0283]
(2)gst pull-down实验
[0284]
1)取等量的pgex-kg空载-gst和pgex-kg-krt15-gst融合蛋白溶液，分别加入40μl gst琼脂糖珠，4℃翻转孵育6小时。
[0285]
2)瞬时离心后去上清，小心地加入适量的1
×
pbs清洗gst琼脂糖珠4-5次，待用。
[0286]
3)使用非变性裂解液裂解足量的细胞(约6-8个汇合度为90％的10cm培养皿)，4℃，13,000rpm离心20分钟，取上清，测定浓度后待用。
[0287]
4)将细胞蛋白溶液平均分成两份，分别与结合pgex-kg空载融合蛋白的gst琼脂糖珠、结合pgex-kg-krt15融合蛋白的gst琼脂糖珠混合，4℃翻转孵育过夜。
[0288]
5)瞬时离心后去上清，使用非变性裂解液洗gst琼脂糖珠一次，再使用适量的1
×
pbs清洗gst琼脂糖珠4-5次。
[0289]
6)加入2
×
蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，瞬时离心获得与krt15相互作用的蛋白集合，然后通过sds-page电泳进行分离。
[0290]
7)经考马斯亮蓝染液染色并脱色后，以空载组为对照，分别切取两组的差异条带，并将高丰度蛋白和低丰度蛋白分管保存，进行后续的质谱鉴定。质谱鉴定由中科新生命完成。
[0291]
15、细胞水平相关实验
[0292]
(1)真核细胞转染sirna/质粒dna(invitrogene lipofectamine 2000transfection reagent 11668019)
[0293]
1)sirna序列：
[0294][0295]
2)取对数生长期的细胞接种于六孔板中，37℃培养16-18小时，细胞贴壁后的汇合度达30％-50％。
[0296]
3)如下配制反应试剂：
[0297]
5μl lipofectamine 2000 250μl oppoti-mem
[0298]
5μl sirna(100pmol)/2.5μg质粒dna 250μl oppoti-mem
[0299]
室温条件下孵育5分钟
[0300]
4)将稀释后的转染试剂和sirna/质粒dna温和混匀，室温孵育20分钟，使其形成转染复合物。
[0301]
5)细胞换液：弃去原细胞培养基，使用恢复至室温的pbs清洗两遍，再使用无血清无抗生素的rpmi 1640培养基洗一至两次，然后加入2ml无血清无抗生素的rpmi 1640培养基，将转染复合物滴加入培养板中。
[0302]
6)37℃培养6小时后更换完全培养基终止转染，继续培养48小时后收集细胞，western blot检测靶蛋白的敲降情况。
[0303]
(2)构建稳定敲降细胞系
[0304]
1)生长状态良好的hek293ft细胞接种于6cm细胞培养皿中，37℃培养16-18小时。
[0305]
2)待细胞贴壁后生长至汇合度为70％时，将病毒包装质粒和plko.1-shkrt15质粒转染至kek293ft细胞中，转染步骤同上，转染体系如下：
[0306][0307]
lipofectamine 2000 18μl lipofectamine 2000加入至500μl oppoti-mem培养基
[0308]
3)转染完成后，37℃培养6小时，然后弃原培养基，加入3ml含30％fbs的dmem培养基继续培养。
[0309]
4)每隔24小时一次病毒上清，4℃保存，共收集两次。
[0310]
5)将两次收集的病毒上清合并，然后使用0.22μm滤膜进行过滤，分装后可置于4℃短期保存，-80℃长期保存。
[0311]
6)病毒上清感染靶细胞：待感染的靶细胞于感染前24小时接种至六孔板中，汇合度达50％时，更换为1ml新鲜的完全培养基，然后加入0.5ml病毒上清和8μg/ml的聚凝胺。
[0312]
7)37℃培养12小时后更换为新鲜的完全培养基，继续培养24小时后，将细胞按照1:3进行传代。
[0313]
8)确定嘌呤霉素在靶细胞中的杀伤浓度：生长状态良好的靶细胞接种于24孔板中，汇合度达50％时，按照0、0.5、1、2、4μg/ml的浓度配制嘌呤霉素工作液，然后加入细胞中，培养3天后，观察细胞状态，以不加嘌呤霉素组为阴性对照，选择处理3天后细胞全部死亡的浓度为靶细胞的杀伤浓度。
[0314]
9)按照确定的杀伤浓度，加入嘌呤霉素进行筛选，同时设置阴性对照，37℃培养三天后获得稳定敲降细胞。
[0315]
(3)细胞增殖能力检测
[0316]
1)细胞培养至对数生长期，使用胰酶消化细胞，然后加入完全培养基终止消化获得细胞悬液。
[0317]
2)取10μl细胞悬液加入至细胞计数板，使用bio-rad计数仪进行计数。
[0318]
3)计算每组细胞所需的细胞悬液体积，使用rpmi1640完全培养基稀释细胞，调整细胞密度为2
×
104个/ml。
[0319]
4)取100μl细胞悬液接种至96孔板中，即每孔接种2000个细胞，每组设置4个复孔，共接种6板，置于含5％co2的37℃敷箱中进行培养。
[0320]
5)细胞完全贴壁时，取出一板96孔板进行cck8检测：按照无血清无抗素的rpmi培养基：cck8＝10：1的比例配制cck8工作液，弃96孔板中的原培养基，每孔培养基中加入cck8工作液，震荡混匀，置于37℃培养箱中避光培养1小时，然后使用酶标仪检测细胞在450nn处的吸光值(即od450值)，并将此板定义为0天。
[0321]
6)每隔24小时取出一板96孔板检测细胞的od450值，获得0-5天六个时间点的od450值。
[0322]
7)数据分析：计算各组细胞在0-5天的od 450值的平均值，并设置为纵坐标，以天数为横坐标，绘制细胞的生长曲线。
[0323]
(4)细胞周期分布检测(同仁化学cell cycle assay kit c543)
[0324]
1)pbs清洗待检测细胞，然后使用胰酶消化，培养基终止后收集细胞悬液，1,000rpm，离心3分钟，弃上清获得细胞沉淀。
med biol res 39,1101-1113.
[0349]
giroux,v.,lento,a.a.,islam,m.,pitarresi,j.r.,kharbanda,a.,hamilton,k.e.,whelan,k.a.,long,a.,rhoades,b.,tang,q.,et al.(2017).long-lived keratin 15 esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.j clin invest 127,2378-2391.
[0350]
giroux,v.,stephan,j.,chatterji,p.,rhoades,b.,wileyto,e.p.,klein-szanto,a.j.,lengner,c.j.,hamilton,k.e.,and rustgi,a.k.(2018).mouse intestinal krt15 crypt cells are radio-resistant and tumor initiating.stem cell reports10,1947-1958.
[0351]
gomez-morales,m.,camara-pulido,m.,miranda-leon,m.t.,sanchez-palencia,a.,boyero,l.,gomez-capilla,j.a.,and farez-vidal,m.e.(2013).differential immunohistochemical localization of desmosomal plaque-related proteins in non-small-cell lung cancer.histopathology 63,103-113.
[0352]
jih,d.m.,lyle,s.,elenitsas,r.,elder,d.e.,and cotsarelis,g.(1999).cytokeratin 15 expression in trichoepitheliomas and a subset of basal cell carcinomas suggests they originate from hair follicle stem cells.j cutan pathol 26,113-118.
[0353]
north,j.p.,mccalmont,t.h.,fehr,a.,van zante,a.,stenman,g.,and leboit,p.e.(2015).detection of myb alterations and other immunohistochemical markers in primary cutaneous adenoid cystic carcinoma.am j surg pathol 39,1347-1356.
[0354]
omary,m.b.,coulombe,p.a.,and mclean,w.h.(2004).intermediate filament proteins and their associated diseases.n engl j med 351,2087-2100.
[0355]
omary,m.b.,ku,n.o.,strnad,p.,and hanada,s.(2009).toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease.j clin invest 119,1794-1805.
[0356]
pal,s.k.,sakamoto,k.,aragaki,t.,akashi,t.,and yamaguchi,a.(2013).the expression profiles of acidic epithelial keratins in ameloblastoma.oral surg oral med oral pathol oral radiol 115,523-531.
[0357]
sanchez-palencia,a.,gomez-morales,m.,gomez-capilla,j.a.,pedraza,v.,boyero,l.,rosell,r.,and farez-vidal,m.e.(2011).gene expression profiling reveals novel biomarkers in nonsmall cell lung cancer.int j cancer 129,355-364.
[0358]
schweizer,j.,bowden,p.e.,coulombe,p.a.,langbein,l.,lane,e.b.,magin,t.m.,maltais,l.,omary,m.b.,parry,d.a.,rogers,m.a.,and wright,m.w.(2006).new consensus nomenclature for mammalian keratins.j cell biol174,169-174.
[0359]
tai,g.,ranjzad,p.,marriage,f.,rehman,s.,denley,h.,dixon,j.,mitchell,k.,day,p.j.,and woolf,a.s.(2013).cytokeratin 15 marks basal epithelia in developing ureters and is upregulated in a subset of urothelial cell carcinomas.plos one 8,e81167.
[0360]
waseem,a.,dogan,b.,tidman,n.,alam,y.,purkis,p.,jackson,s.,lalli,a.,machesney,m.,and leigh,i.m.(1999).keratin 15 expression in stratified epithelia:downregulation in activated keratinocytes.j invest dermatol 112,362-369.
[0361]
yang,r.,zheng,y.,burrows,m.,liu,s.,wei,z.,nace,a.,guo,w.,kumar,s.,cotsarelis,g.,and xu,x.(2014).generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells.nat commun 5,3071.
[0362]
zekri,a.n.,el-sisi,e.r.,abdallah,z.f.,ismail,a.,and barakat barakat,a.(2017).gene expression profiling of circulating cd133( )cells of hepatocellular carcinoma patients associated with hcv infection.j egypt natl canc inst 29,19-24.