一种解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种解析大脑中枢特定核团单级输出网络的病毒载体及其应用。


背景技术：

2.神经环路是大脑执行一切功能的物质基础，人脑中约有10
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个神经元通过约10
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个突触彼此相互交织形成了立体的脑神经网络，因此，解析大脑的神经环路连接是理解脑工作机制的基础。工具病毒作为目前最高效、应用最广的神经网络示踪手段，其具有易改造、传播方向特定、可携带外源基因且持续稳定表达等诸多优势，是绘制大脑连接图谱的利器。随着分子生物学和基因靶向技术的革新，现有的神经环路标记工具库虽然被不断地扩容，但用于解析直接输出神经网络的工具病毒仍然短缺。
3.目前，高滴度的重组腺相关病毒1型(raav1)和胸腺嘧啶核苷激酶(tk)基因缺失的单纯疱疹病毒1型毒株h129(h129-δtk-tdt)是常用的顺向跨单级突触病毒。高滴度的raav1在顺向跨突触传递过程中，只有很少量的病毒粒子能够进入下游脑区的神经元，因此一个放大步骤是必要的，通常使用raav1-hsyn-cre(》1
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vg/ml)。此外，高滴度的raav1-hsyn-cre会逆向入侵上一级神经元的轴突末端，这使得利用raav1顺向跨单级突触系统解析大脑中枢特定核团单级输出网络不严谨。单纯疱疹病毒1型h129毒株存在轴突末端逆向吸收现象，而且病毒毒力较大，这使得使用h129-δtk-tdt标记的结果不够严谨，且下游脑区被标记的细胞容易病变，需要借助免疫组化染色来增加荧光强度。因此，开发低毒、严谨的解析大脑单级输出网络的病毒载体具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中的不足，本发明的目在于提供一种解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体，该病毒能够精准地解析大脑特定核团神经元的直接输出网络。本发明利用重组腺相关病毒具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广而且能够介导基因在动物体内长期稳定表达等优势，以其作为研究神经网络的结构与功能的载体。本发明通过基因重组提供了一种腺相关病毒载体，其通过两组启动子同时实现了在神经元的轴突末端高丰度荧光蛋白的定位，以及细胞核的荧光蛋白定位，从而屏蔽掉神经元的“过路”纤维，实现了对大脑特定核团神经元直接输出网络的精准标记。该载体在神经科学领域尤其在非人灵长类神经输出网络的解析中具有巨大的应用价值和市场前景。
5.为实现以上目的，本发明一个方面提供了一种解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体中包含重组腺病毒核心质粒；
6.重组腺病毒核心质粒中包含至少两个启动子，以及由不同启动子分别驱动的能够到达轴突末端的第一标记蛋白和能够达到细胞核的第二标记蛋白的编码基因。
7.进一步地，所述重组腺病毒核心质粒中还编码能够提高第一标记蛋白表达丰度的转录激活蛋白。
8.进一步地，所述第一标记蛋白选自synaptophysin与egfp、bfp、cfp、gfp、yfp、rfp、irfp、cerulean、venus、egfp、ecfp、eyfp、ebfp、dsred、dtomato、tdtomato、mcherry、mkate、mapple、mbanana、mcitrine、morange、mplum、tagrfp、tagbfp、hrp任一种的融合蛋白，优选为synaptophysin-egfp融合蛋白。
9.进一步地，所述第二标记蛋白选自sv40nls与mcherry、bfp、cfp、gfp、yfp、rfp、irfp、cerulean、venus、egfp、ecfp、eyfp、ebfp、dsred、dtomato、tdtomato、mcherry、mkate、mapple、mbanana、mcitrine、morange、mplum、tagrfp、tagbfp或hrp中的任一种的融合蛋白，优选为sv40nls-mcherry融合蛋白。
10.进一步地，所述第一标记蛋白的启动子与第二标记蛋白的启动子不同，其中第一标记蛋白的启动子选自tretight、uas、lexaop或uas，第二标记蛋白的启动子选自cmv、cag、ef1α、nef1α、hsyn、camkiiα、vgat、thy1、tre、uas、gfap或gfaabc1d。
11.进一步地，所述转录激活蛋白选自tta转录激活蛋白、gal4、lexa、qf，优选地tta转录激活蛋白的基因如seq id no.7所示。
12.进一步地，tretight启动子如seq id no.1所示、cmv启动子如seq id no.4所示。
13.进一步地，synaptophysin-egfp融合蛋白的序列如seq id no.2所示。
14.进一步地，sv40nls-mcherry融合蛋白的序列如seq id no.5所示。
15.本发明另一个方面提供了一种重组腺病毒核心质粒，所述重组腺病毒核心质粒中包含至少两个启动子，以及由不同启动子分别驱动的能够到达轴突末端的第一标记蛋白和能够达到细胞核的第二标记蛋白的编码基因。
16.进一步地，所述重组腺病毒核心质粒中还包含能够提高第一标记蛋白表达丰度的转录激活蛋白。
17.本发明又一个方面提供了一种重组腺相关病毒载体，该重组腺相关病毒包含上述重组腺相关病毒核心质粒。
18.本发明再一个方面提供了上述重组腺病毒核心质粒或上述的重组腺相关病毒在神经网络标记中的应用。
19.进一步地，神经网络标记为对神经单级输出神经网络的标记。
20.本发明再一个方面提供了上述的重组腺相关病毒作为神经环路示踪病毒的应用。
21.进一步地，所述神经环路示踪为对神经单级输出神经网络进行示踪。
22.具体地，一种解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体的构建方法包括下述步骤：
23.1)重组腺病毒核心质粒构建：该载体是在同一个重组aav基因组中依次插入tretight启动子(seq id no.1所示)、synaptophysin-egfp融合蛋白(seq id no.2所示)、cw3sl转录后调控元件(seq id no.3所示)、cmv启动子(seq id no.4所示)，sv40nls-mcherry融合蛋白(seq id no.5所示)、t2a连接序列(seq id no.6所示)、tta基因(seq id no.7所示)以及cw3sl转录后调控元件(seq id no.3所示)，构建重组腺相关病毒核心质粒paav-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl。
24.2)重组腺相关病毒制备方法如下：将包装raav所需的辅助质粒paav helper、5型血清型aav衣壳质粒、核心质粒paav-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl共同转染hek293细胞，分别收集上清和沉淀，利用碘克沙醇密度梯
度离心法纯化病毒，获得重组腺相关病毒。
25.3)重组腺相关病毒应用：该病毒通过tretight启动子驱动synaptophysin-egfp融合蛋白的表达，利用synaptophysin轴突分布的性质将egfp荧光蛋白携带至轴突末端，从而达到标记神经元轴突末端的效果；通过启动子cmv驱动核定位红色荧光蛋白sv40nls-mcherry以及tta基因的表达，sv40nls信号肽可使mcherry入核将神经元的细胞核标记成红色，而tta转录激活蛋白作用于tretight启动子从而使synaptophysin与egfp基因高丰度表达。基于上述原理，该重组腺相关病毒可以用于解析特定核团的一级输出网络。
26.与现有方法相比，本发明具有以下优点：
27.1、本发明利用同一个重组aav基因组中多个启动子驱动多个目的基因表达，更为精确的解析大脑单级输出神经网络。
28.2、本发明解决了raav1顺向跨单级突触系统不严谨、h129逆向标记以及毒性较大的应用范围限制，避免了普通的raav9标记过路纤维的缺陷。
29.3、本发明利用了tre-tta信号放大系统以及synaptophysin定位功能可使egfp蛋白高丰度的表达在神经元轴突末端，避免了普通raav9标记神经元随着轴突延伸信号逐渐递减的现象。
30.4、本发明还可结合神经细胞特异性启动子，用于特定类型神经元单级输出神经网络的研究。
31.5、本发明在哺乳动物特定脑区的特定类型神经元单级输出神经网络、环路功能研究等方面具有广泛的应用价值和前景。
32.6、本发明在利用腺相关病毒进行基因治疗中多基因递送方面具有潜在的应用价值。
附图说明
33.图1解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体及其工作原理示意图。
34.图2为raav5-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl病毒与对照病毒raav9-ef1α-egfp-wpre-pa感染运动皮层的结果，其中a图中m1的细胞被raav5-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl标记成了红色，图a’中m1的细胞被raav9-ef1α-egfp-wpre-pa标记成绿色。图b和c是在m1注射raav5-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl病毒的部分纤维分布展示，图b’和c’是在m1注射raav9-ef1α-egfp-wpre-pa病毒与b和c对应大脑区域的纤维分布展示，a、a’、b、b’、c、c’、d、d’、e、e’、f、f’分别是cc、不同位置的cpu、apt、zi、cp脑区放大图。用raav5-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl标记的神经元仅局限在中部cpu(c图)、apt(d图)有纤维分布，而经典常用的病毒raav9-ef1α-egfp-wpre-pa标记神经元绿色荧光不仅在中部cpu(c图)、apt(d图)出现，在cc(a’图)、背部cpu(b’图)、zi(e’图)、cp(f’图)也有分布，在cc、背部cpu、zi、cp出现的绿色荧光仅是m1神经元投射到下游脑区轴突路过而产生的荧光蛋白遗留现象，实际m1神经元对这些脑区并不存在投射。以上结果表明raav5-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl可以精确的解析大脑单级输出神经网络，并解决以往工具标记过路纤维的缺陷。
具体实施方式
35.为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
36.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
37.实施例1：paav-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl载体构建与重组腺相关病毒raav5-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl的制备。
38.paav-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl载体是在aav载体质粒的itr之间依次插入tretight启动子(seq id no.1所示)、synaptophysin-egfp融合蛋白基因(seq id no.2所示)、cw3sl转录后调控元件(seq id no.3所示)、cmv启动子(seq id no.4所示)，sv40nls-mcherry融合蛋白基因(seq id no.5所示)、t2a连接序列(seq id no.6所示)、tta基因(seq id no.7所示)以及cw3sl转录后调控元件(seq id no.3所示)，该载体的构建委托北京擎科生物科技有限公司完成。为了提高raav包装以及感染效率，选取了包装容量较大的aav5血清型作为包装血清型。采用传统的三质粒包装腺相关病毒的方法，对重组表达载体进行病毒包装，并用碘克沙醇梯度密度离心法进行浓缩和纯化，最后用sybr green qpcr法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得raav-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl病毒的滴度为1.14
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vg/ml。
39.seq id no.1：315bp
40.gcgtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttatccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcc
41.seq id no.2：549aa
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43.seq id no.3：432bp
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mcherry-t2a-tta-cw3sl标记的神经元仅局限在中部cpu(c图)、apt(d图)有纤维分布，而经典常用的病毒raav9-ef1α-egfp-wpre-pa标记神经元绿色荧光不仅在中部cpu(c图)、apt(d图)出现，在cc(a’图)、背部cpu(b’图)、zi(e’图)、cp(f’图)也有分布，在cc、背部cpu、zi、cp出现的绿色荧光仅是m1神经元投射到下游脑区轴突路过而产生的荧光蛋白遗留现象，实际m1神经元对这些脑区并不存在投射。以上结果表明raav5-tretight-synaptophysin-egfp-cw3sl-cmv-sv40nls-mcherry-t2a-tta-cw3sl可以精确的解析大脑单级输出神经网络，并解决以往工具标记过路纤维的缺陷。