一种长效微粒胶原蛋白植入剂的制作方法

1.本发明涉及一种注射植入剂。具体来说，涉及一种性能优异的一种长效微粒胶原蛋白植入剂。
2.技术背景胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，它是曲3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30%以上。
3.胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分。主要存在于人体皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、内脏等部位，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质。在人体皮肤成分中，有70%是由胶原蛋白所组成。
4.当胶原蛋白不足时，不仅皮肤及骨骼会出现问题，对内脏器官也会产生不利影响。也就是说，胶原蛋白是维持身体正常活动所不可缺少的重要成分。同时也是使身体保持年轻、防止老化的物质。另外，胶原蛋白还可以预防疾病，改善体质，对美容和健康都很有帮助。现在胶原蛋白正慢慢进入美容护肤领域。
5.胶原蛋白在炎症和抗原反应中引起的作用最小，已被美国食品和药品管理局（fda）批准用于许多类型的医疗应用，包括伤口辅料和人工皮肤。
6.然而，胶原蛋白体内存留时间短等重大不足。
7.虽然，现有一些长效胶原蛋白技术，例如：cn 101648989（长效型胶原蛋白及其制造方法）：本发明公开了一种长效型胶原蛋白及其制造方法，是将一猪皮经过刮除多余组织、 去除油脂、膨润、消化、离心分离、盐析、收集下层沉淀物、冷冻干燥后即可得一胶 原蛋白，再将该胶原蛋白与γ-聚麸胺酸(γ-pga)混合，同时加入一戊二醛溶液并搅拌均 匀，进行第一交联，再重复加入该戊二醛溶液搅拌均匀，进行第二次交联后，即可得 该长效型胶原蛋白，其可解决习用胶原蛋白的存留时间过短、必须常常补充施打，以 及会残留高浓度的戊二醛，具有生物毒性会危害人体健康等缺点；cn102924731a（一种三重交联的胶原蛋白及制造方法和用途）：一种三重交联胶原蛋白的制造方法，包括：提供一可溶性的胶原蛋白样品；混合该胶原蛋白样品与一第一交联剂，以形成一重交联的胶原蛋白；混合该一重交联的胶原蛋白与一第二交联剂，以形成二重交联的胶原蛋白；以及混合该二重交联的胶原蛋白与一第三交联剂，以形成三重交联的胶原蛋白。其中，第一交联剂、第二交联剂、及第三交联剂分别选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组，且第一交联剂异于第二交联剂，第三交联剂异于第一交联剂及第二交联剂；但是，上述技术使用化学改性方法，虽然效果显著，但是存在化学试剂残留与改性过程中形成有害物质的风险, 此外，还有反应条件不温和、产生副产物、特异性差、催化效率和产率低及工过程中胶原蛋白有损失等不足。
8.更重要的是，上述胶原蛋白是在均相中整体交联的，或者交联成一个巨大的粒子，
不是很小的微粒，更不是大小基本均匀的微粒，然而，使用时却是较小的粒子，因而，其表观疗效不一致，如疗效期一不致长。
9.此外，其制剂基本为凝胶剂，因其水分散体系粘度高在生产使用中造成诸多不便，如剂量分装不准，注射时通针性不好。
10.因此，现实中需要一种胶原蛋白植入剂，其有长效且效期一致长(波动小)，通针性好等优势。


技术实现要素：

11.本发明的目的就是提供一种性能改善的长效且效期一致长(波动小)、通针性好的微粒胶原蛋白植入剂及其制备方法。
12.本发明人发现，通过血红素过氧化物酶把普通胶原蛋白改性成大小基本均匀的微粒交联胶原蛋白，不仅可以延长其在体内的作用时间，而且效期一致长(波动小)，还使其水分散体系的粘度下降，解决上述诸多问题，如可准确分装剂量，使注射时通针性较好；此外，还可以减少有害物质的混入、使反应条件温和、降低工过程中胶原蛋白的损失、提高特异性、不产生副产物、提高催化效率和提高产率等。
13.血红素过氧化物酶 (hemeperoxidase)是过氧化物酶中的一部分，属于氧化还原酶，利用过氧化氢作为电子受体氧化各种有机和无机底物，如酪氨酸残基上的酚，从而形成二酪氨酸和寡酪氨酸交联。
14.基于此，完成了本发明。
15.本发明涉及一种（性能改善的）长效且效期一致长(波动小)、通针性好的微粒胶原蛋白植入剂的制备方法，该方法包括：（1）、制备温度不高于4℃的包括表面活性剂及挥发性的不完全溶于水的有机溶剂的溶液，即油相；（2）、制备温度不高于4℃的包括胶原蛋白和血红素过氧化物酶的水溶液，即水相；（3）、上述水溶液制备完成后30分钟内把上述水溶液与上述有机溶剂的溶液混合，并使它们形成油包水型乳液，温度保持4℃至-4℃24小时以上，较佳地48小时以内，使胶原蛋白基本交联；（4）、上述胶原蛋白基本交联后过滤上述乳液获取微粒，用10-40%（较佳地10-30%，体积比）乙醇水溶液洗涤上述微粒，除去其中上述表面活性剂、上述有机溶剂及上述酶等残余物；（5）、低温冷冻法除去微粒中残余溶剂。
16.本发明涉及一种（性能改善的）长效且效期一致长(波动小)、通针性好的微粒胶原蛋白植入剂，该胶原蛋白植入剂包括：使用血红素过氧化物酶交联的胶原蛋白微粒，微粒的粒径大小位于0.5μm至25μm之间。
具体实施方式
17.较佳地，过滤上述乳液获取微粒过程中，滤去粒径大于25μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与25μm间的微粒；更佳地，滤去粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；最佳地，滤去粒径大于25μm及小于10μm的微粒或滤去粒径大于
15μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于10μm与25μm间的微粒或保留粒径位于5μm与15μm间的微粒。
18.较佳地，上述水性溶液，即水相中胶原蛋白的质量浓度为0.1%-10%，更佳地0.5%-5%；较佳地，上述血红素过氧化物酶的用量与上述胶原蛋白的用量的比例为1-10u/g，较佳地4-8u/g，更佳地5-6u/g。
19.上述胶原蛋白为类人胶原蛋白，更佳地为人源化胶原蛋白。
20.上述有机溶剂包括但不限于c1～c6酸与c1～c6醇形成的酯，如乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、戊酸戊酯、异戊酸异戊酯等；c1～c6醇与c1～c6醇形成的醚，如乙醚，甲乙醚；c3～c6酮，如丙酮。
21.上述表面活性剂包括但不限于亲油性表面活性剂，特别是hlb值为3～8的亲油性表面活性剂，其实例如司盘类表面活性剂，如span20 、40、60或 80，糖酯类表面活性剂，如c12～c18酸葡萄糖酯；c12～c18酸丙二醇酯；c12～c18酸丙三醇（甘油）酯；以共它们的组合。
22.上述亲油性表面活性剂可与其重量比0.1～5%的亲水性表面活性剂合用，如tween 80。
23.血红素过氧化物酶应在油包水型乳液形成前加入水相中，不应在油包水型乳液形成前或后加入油相中，否则胶原蛋白植入剂性能下降或消失。
24.上述油相与上述水相的体积比为2.5～10，较佳为3～6。
25.上述水性溶液制备完成后应在30分钟内把上述水性溶液与油性溶液混合，较佳10分钟内，最佳地5分钟内。
26.较佳地，滤去粒径大于25μm及小于5μm的微粒；更佳地，滤去粒径大于25μm及小于10μm的微粒。
27.低温冷冻法包括冷冻干燥法及喷雾冷冻干燥法。
28.上述微粒胶原蛋白植入剂中的微粒的粒径大小，较佳地，位于5μm至25μm之间，更佳地，位于10μm至25μm之间或5μm至15μm之间。
29.本发明工艺中了采用酶法交联胶原蛋白，与化学交联工艺和物理交联工艺相比，有较大优势：反应条件温和、不产生副产物、高特异性以及高催化效率和产率。
30.此外，酶温和的反应条件减少了加工过程中胶原蛋白的损失。
31.实施例下非选择性实施例，即植入剂的制备方法，进一步描述了本发明范围内的优选实施例。在本发明的范围内这些实施例还可有许多变化。
32.实施例1（1）、制备温度4℃的含2.5%的表面活性剂：span 80的乙酸乙酯的溶液，即得油相；（2）、制备温度4℃的含4%的胶原蛋白和血红素过氧化物酶的水溶液，上述血红素过氧化物酶的用量与上述胶原蛋白的用量的比例为5u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后20至30分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌30分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持4℃至0℃ 24小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为5；
（4）、上述胶原蛋白基本交联后过滤上述乳液获取微粒：用滤膜滤去粒径大于25μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与25μm间的微粒，用30%乙醇水溶液洗涤上述微粒，除去其中上述表面活性剂、上述有机溶剂及上述酶等残余物；（5）、在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去微粒中残余溶剂，即得。
33.同法制作13批次。
34.实施例2（1）、制备温度0℃的含5%的表面活性剂：油酸葡萄糖酯的乙醚的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含4.5%的胶原蛋白和血红素过氧化物酶的水溶液，上述血红素过氧化物酶的用量与上述胶原蛋白的用量的比例为5u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至10分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为4；（4）、上述胶原蛋白基本交联后过滤上述乳液获取微粒：用滤膜滤去粒径大于5μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与5μm间的微粒，用20%乙醇水溶液洗涤上述微粒，除去其中上述表面活性剂、上述有机溶剂及上述酶等残余物；（5）、在真空冷冻干燥机中-60
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80℃冷冻干燥48小时除去微粒中残余溶剂，即得。
35.同法制作13批次。
36.实施例3（1）、制备温度0℃的含8%的表面活性剂：c12酸（月桂酸）甘油酯的丙酮的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含8%的胶原蛋白和血红素过氧化物酶的水溶液，上述血红素过氧化物酶的用量与上述胶原蛋白的用量的比例为10u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后1至5分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌40分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为6；（4）、上述胶原蛋白基本交联后过滤上述乳液获取微粒：用滤膜滤去粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒，用10%乙醇水溶液洗涤上述微粒，除去其中上述表面活性剂、上述有机溶剂及上述酶等残余物；（5）、在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去微粒中残余溶剂，即得。
37.同法制作13批次。
38.实施例4（1）、制备温度0℃的含10%的表面活性剂：硬脂（c18）酸丙二醇酯及0.1%的tween 80的异戊酸异戊酯的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含5%的胶原蛋白和血红素过氧化物酶的水溶液，上述血红素过氧化物酶的用量与上述胶原蛋白的用量的比例为8u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为8；（4）、上述胶原蛋白基本交联后过滤上述乳液获取微粒：用滤膜滤去粒径大于15μm
及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与15μm间的微粒，用35%乙醇水溶液洗涤上述微粒，除去其中上述表面活性剂、上述有机溶剂及上述酶等残余物；（5）、在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去微粒中残余溶剂，即得。
39.同法制作13批次。
40.实施例5（1）、制备温度0℃的含7%的表面活性剂：span 20的乙酸丁酯的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含3.5%的胶原蛋白和血红素过氧化物酶的水溶液，上述血红素过氧化物酶的用量与上述胶原蛋白的用量的比例为4u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌20分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为7；（4）、上述胶原蛋白基本交联后过滤上述乳液获取微粒：用滤膜滤去粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒，用25%乙醇水溶液洗涤上述微粒，除去其中上述表面活性剂、上述有机溶剂及上述酶等残余物；（5）、在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去微粒中残余溶剂，即得。
41.同法制作13批次。
42.实施例6（1）、制备温度0℃的含6%的表面活性剂：软酯酸（c16酸）蔗糖酯及0.1%的tween 80的乙酸甲酯的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含6%的胶原蛋白和血红素过氧化物酶的水溶液，上述血红素过氧化物酶的用量与上述胶原蛋白的用量的比例为8u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌50分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为9；（4）、上述胶原蛋白基本交联后过滤上述乳液获取微粒：用滤膜滤去粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒，用25%乙醇水溶液洗涤上述微粒，除去其中上述表面活性剂、上述有机溶剂及上述酶等残余物；（5）、在真空冷冻干燥机中-60
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80℃冷冻干燥48小时除去微粒中残余溶剂，即得。
43.同法制作13批次。
44.实施例7（1）、制备温度0℃的含5%的表面活性剂：油酸葡萄糖酯的乙醚的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含4.5%的胶原蛋白和血红素过氧化物酶的水溶液，上述血红素过氧化物酶的用量与上述胶原蛋白的用量的比例为5u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至10分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为4；（4）、上述胶原蛋白基本交联后过滤上述乳液获取微粒：用滤膜滤去粒径大于25μm及小于10μm的微粒，保留粒径位于10μm与25μm间的微粒，用20%乙醇水溶液洗涤上述微粒，除去其中上述表面活性剂、上述有机溶剂及上述酶等残余物；
（5）、在真空冷冻干燥机中-60
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80℃冷冻干燥48小时除去微粒中残余溶剂，即得。
45.同法制作13批次。
46.对照例1～7-1除不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）及小于0.5μm或5μm或10μm或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
47.对照例1～7-2除不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
48.对照例1～7-3除不滤去粒径小于0.5μm或5μm或10μm或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
49.对照例1～7-4除血红素过氧化物酶不（直接）加入水相中，而是加入油相中外，其他均与各自对应的实施例相同。
50.对照例1～7-5除不添加表面活性剂、不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）及小于0.5μm或5μm或10μm或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
[0051] 测试例1通针性能测试原理：通针性能越好，相同量的混悬液在同一条件下通过同一针头所需时间越少。
[0052]
方法：取相同重量（35mg）的上述实施例、对照例及市售品胶原蛋白（35mg,博泰：弗缦，并按实施例的方法：在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去溶剂水制得的冻干剂，其用作基准）加入用相同量（5ml）的医用注射用生理盐水经相同时间相同方式（如同一振摇方法）复溶（重构）成混悬液，取相同量混悬液装于同一注射器（针头也不变，清洗干净后干燥重复使用）中，用同等的恒定压力推注射器使其中混悬液排完，测定所需时间。最后分别计算上述实施例及对照例测得的时间与市售品测得的时间的比值，以该比值衡量上述实施例及对照例的通针性能，该比值越小，通针性能越强，该比值越大，通针性能越弱。
[0053]
测试结果见表1～7。
[0054] 测试例2体外降解时间测试取相同重量胶原蛋白（35mg）的上述实施例、对照例及市售品胶原蛋白（35mg,商品名：博泰：弗缦，并按实施例的方法：在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去溶剂水制得的冻干剂，其用作基准）加入用相同量(100ml，浓度0.035%)的医用注射用生理盐水（ph值7.0）经相同时间相同方式复溶成混悬液。上述混悬液中均加入相同量的胶原蛋白水解酶（蜡样芽孢杆菌蛋白酶,从蜡样芽孢杆菌纯化分离），上述胶原蛋白水解酶用量与上述胶原蛋白重量比为4u/mg，之后均置入温度37℃、相对湿度70%的恒温恒湿的环境中，于0hr、1hr、3hr、5hr、7hr、9hr、11hr、13hr、15hr、17hr、
……
取样,直至下述所述的吸光度值a基本稳定（波动范围小于2%），该稳定吸光度值a的平均值表示为a0。
[0055]
取样后，立刻90℃灭酶10min，待降至室温，4000r/min离心10min，得到澄清的水
解液。取5ml上述水解液样品溶液，加入5ml 15% ( w/w) 三氯醋酸( tca) 水溶液，混匀后静置10min，4 000r /min离心10min，上清液稀释至1 ～ 10mg /ml 浓度的溶液，取稀释液1ml 加入4ml 双缩脲试剂，混匀，静置30min。在波长540nm 处测定吸光度值a。按线性回归方程可计算降解产生的多肽浓度c( mg /ml)（参见文献1：肉类工业. 2011,(11)，总第367期，第21-24页，刘丽莉、杨协力，胶原蛋白酶酶解牛骨胶原蛋白的动力学研究）。
[0056]
上述吸光度值a（或降解产生的多肽浓度c）反映样品溶液中己降解的胶原蛋白的量，上述吸光度值a
0-a（或c
0-c，c0表示吸光度值a基本稳定后的平均值a0求得的降解产生的多肽浓度，即胶原蛋白完全降解产生的多肽浓度,反应初始胶原蛋白的量）反映样品溶液中残留的胶原蛋白的量，由依米氏方程可知蛋白质酶降解在较低浓度时呈一级反应特征（参见上文献1），故可用 ln（a
0-a）（或ln（c
0-c））的值与时间t作图，求其降解斜率k，通过该斜率k及公式t
0.99
=ln100/k计算出胶原蛋白完全降解（降解99%或残留1%, t=ln( c0＇/ c＇)/k,
t c＇/ c0＇=0.01，其中c0＇与 c＇分别表示初始胶原蛋白的量及残留胶原蛋白的量）的时间t
0.99
。
[0057]
最后分别计算上述实施例及对照例测得的胶原蛋白完全降解的时间t
0.99
与市售品测得的胶原蛋白完全降解的时间t
0.99
（以其平均值计）的比值，以该比值衡量上述实施例及对照例的相对体内存留性能，该比值越大，体内存留（长效）性能越强，该比值越小，体内存留（长效）性能越弱。该比值波动越小，胶原蛋白在体内存留（长效）性能变化越小；该比值波动越大，胶原蛋白在体内存留（长效）性能变化越大。
[0058]
测试结果见表1～7。
[0059]
表1 实施例1对照例1-1对照例1-2对照例1-3对照例1-4对照例1-5通针性能0.220.460.510.24
‑‑
降解时间比4.3
±
38%5.6
±
64%6.6
±
76%4.53.5
±
54%1.2
±
22%7.9
±
86%
表2 实施例2对照例2-1对照例2-2对照例2-3对照例2-4对照例2-5通针性能0.120.350.420.13
‑‑
降解时间比2.3
±
23%3.7
±
52%4.5
±
64%1.3
±
41%1.1
±
19%6.6
±
79%表3 实施例3对照例3-1对照例3-2对照例3-3对照例3-4对照例3-5通针性能0.260.420.510.32
‑‑
降解时间比5.4
±
34%7.2
±
63%8.1
±
72%3.9
±
53%1.2
±
23%9.8
±
87%表4 实施例4对照例4-1对照例4-2对照例4-3对照例4-4对照例4-5通针性能0.220.410.490.25
‑‑
降解时间比3.4
±
29%5.8
±
51%6.9
±
63%2.5
±
44%1.3
±
26%8.7
±
81%表5 实施例5对照例5-1对照例5-2对照例5-3对照例5-4对照例5-5通针性能0.310.490.580.29
‑‑
降解时间比5.6
±
35%7.8
±
62%9.4
±
72%4.1
±
43%1.4
±
28.6
±
85%
表6 实施例6对照例6-1对照例6-2对照例6-3对照例6-4对照例6-5通针性能0.290.460.580.28
‑‑
降解时间比5.5
±
33%7.1
±
62%9.2
±
76%3.6
±
45%1.2
±
29.7
±
87%表7 实施例7对照例7-1对照例7-2对照例7-3对照例7-4对照例7-5通针性能0.340.590.760.37
‑‑
降解时间比6.5
±
26%8.3
±
63%9.7
±
78%4.7
±
42%1.4
±
30.2
±
88%结果显示：1）、实施例较市售品有更慢的酶水解速率，显著更长的体内存留（长效）性能；2）、实施例较不添加表面活性剂的对照例有更好的体内存留（长效）性能，该对照例体内存留（长效）性能波动性极大；3）、实施例较血红素过氧化物酶不（直接）加入水相中，而是加入油相中的对照例有更好的体内存留（长效）性能，该对照例体内存留（长效）性能极弱；4）、实施例较不滤除较大及较小的颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能波动很大；5）、实施例较不滤除较大颗粒的仅滤除较小颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能波动较大；6）、实施例较不滤除较小颗粒的仅滤除较大颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更长的体内存留（长效）性，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能较短，变波动性也较大；7）、实施例较市售品、不滤除较大及较小的颗粒的对照例及不滤除较大颗粒的仅滤除较小颗粒的对照例有更好的通针性能；实施例与不滤除较小颗粒的仅滤除较大颗粒的对照例有基本一致的通针性能。