一种维持离体组织活性的保存液及其应用的制作方法

本发明涉及类器官生物培养基，尤其涉及一种维持离体组织活性的保存液及其应用。

背景技术：

1、类器官（organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3d）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，能够最大程度地模拟体内组织结构和功能，并能够长期稳定传代培养。

2、保证用于类器官培养的离体组织的细胞活性，同时避免出现污染是目前迫切需要的解决的问题。合适的离体组织保存液在低温下应该具备以下功能：1、维持细胞的活性，减少细胞死亡或者程序性凋亡；2、固定细胞的状态，减少细胞生物进程；3、在植入后能够发挥器官（组织/细胞）原有的功能；4、延长体外保存时间。目前市面上通用的组织保存液，在长时间、远距离运输组织样本时，往往不能满足需求，存在细胞活性低，导致培养获得的类器官数量少，细胞增殖能力弱等情况。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种维持离体组织活性的保存液及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：

3、提供一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：包括溶剂和添加物，所述溶剂为advanced dmem/f-12培养液，所述添加物包括glutamax添加剂、y-27632、连翘脂苷a、丙酮酸钠、青霉素-链霉素、庆大霉素、两性霉素b、聚乙二醇。

4、进一步的，所述glutamax添加剂经稀释至其原液浓度的1%后使用，浓度为1×。

5、进一步的，所述y-27632以dmso为溶剂配制而成，浓度为10μm。

6、进一步的，所述连翘脂苷a浓度为5μg/ml。

7、进一步的，所述丙酮酸钠浓度为1mm。

8、进一步的，所述青霉素-链霉素浓度为100u/ml；所述庆大霉素浓度为5μg/ml；所述两性霉素b浓度为1μg/ml。

9、进一步的，所述聚乙二醇浓度为10μg/ml。

10、进一步的，所述保存液于0 ~ 4℃下，对离体组织的保存时间为72h。

11、提供一种上述任一项所述维持离体组织活性的保存液在肿瘤组织类器官培养中的应用。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

13、本发明选用以advanced dmem/f-12培养液为基底溶剂并添加若干添加物，可提供能量，维持组织细胞最低的生理代谢条件，代替了价格昂贵的胎牛血清（fbs）来培养哺乳动物细胞，在保证样本生物活性的同时降低了成本。

14、本发明选用glutamax添加剂可作为一种辅助能源，特别是当细胞快速分裂时，参与蛋白质的合成和葡萄糖的产生，是细胞生长必需的氨基酸。

15、本发明选用的y-27632是一种细胞渗透性、高效和选择性的rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（rock）抑制剂，通过防止解离诱导的细胞凋亡来增强细胞的存活率，从而提高类器官提取的成功率。

16、本发明选用的连翘脂苷a是一种苯乙醇苷，是cox-2的抑制剂，具有抗炎、抗氧化和神经保护作用。

17、本发明选用的丙酮酸钠是一种在糖酵解途径中产生的小分子化合物，可以清除ros的自由基清除剂，具有抗炎、抗氧化和神经保护作用，被用作缓冲剂、赋形剂和抗氧化剂。

18、本发明选用的青霉素-链霉素、庆大霉素和两性霉素b，可抑制细菌、真菌及支原体等，有效避免组织污染。

19、本发明选用聚乙二醇，可避免保存条件下的温度变化或者溶液渗透差造成的细胞膜破裂。

20、综上，本发明使用简单，对样本的生物特性影响及小，对肿瘤组织有效保存时间达到72h，并能维持细胞活性与增殖能力，可满足异地医院样本的运输要求。

技术特征：

1.一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：包括溶剂和添加物，所述溶剂为advanced dmem/f-12培养液，所述添加物包括glutamax添加剂、y-27632、连翘脂苷a、丙酮酸钠、青霉素-链霉素、庆大霉素、两性霉素b、聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：所述glutamax添加剂经稀释至其原液浓度的1%后使用，浓度为1×。

3.根据权利要求1所述一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：所述y-27632以dmso为溶剂配制而成，浓度为10μm。

4.根据权利要求1所述一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：所述连翘脂苷a浓度为5μg/ml。

5.根据权利要求1所述一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：所述丙酮酸钠浓度为1mm。

6.根据权利要求1所述一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：所述青霉素-链霉素浓度为100u/ml；所述庆大霉素浓度为5μg/ml；所述两性霉素b浓度为1μg/ml。

7.根据权利要求1所述一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：所述聚乙二醇浓度为10μg/ml。

8.根据权利要求1所述一种维持离体组织活性的保存液，其特征在于：所述保存液于0~ 4℃下，对离体组织的保存时间为72h。

9.一种权利要求1~8任一项所述维持离体组织活性的保存液在肿瘤组织类器官培养中的应用。

技术总结本发明公开了一种维持离体组织活性的保存液及其应用，该保存液包括以下组分：GlutaMAX添加剂；Y‑27632；连翘脂苷A；丙酮酸钠；青霉素‑链霉素；庆大霉素；两性霉素B；聚乙二醇；溶剂为Advanced DMEM/F‑12培养液。利用该组织保存液可对临床肿瘤组织样本进行长时间远距离运输，有效保存时间达到72h，不仅维持了肿瘤细胞的较高活性，还可降低培养前被污染的风险，提高肿瘤类器官培养成功率。技术研发人员：顾忠泽,于文龙,李娟娟受保护的技术使用者：江苏运动健康研究院技术研发日：技术公布日：2024/6/5