利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法

本发明涉及一种利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法。

背景技术：

1、肠道微生物组在人体宿主中可作用于分解食物，产生维生素，保护免受有害生物的侵害，增强肠道屏障和控制免疫系统等，同时，肠道微生物定殖与免疫系统的发育过程起着相互加强的作用。克雷伯氏菌寄生于动物呼吸道或肠道，为条件病原菌，是引起人类肺炎的病原菌之一。对多种动物具有高度的病原性，能使人兽发生肺炎、子宫炎、乳房炎及其他化脓性炎症，甚至发生败血症。因此，对于克雷伯氏菌实施快速有效治疗对改善患者预后和减轻社会医疗负担具有非常重要的意义。

2、目前克雷伯氏菌的致病机制目前了解还不十分清楚，常规小鼠的免疫应答与人类的免疫应答不同，使得难以在临床中成功应用临床前验证的免疫治疗方案。因此，对于克雷伯氏菌动物造模，研究人员多用气管内注射菌液的方法建立模型，仍缺乏在肠道菌群中定殖造模的方法。有研究表明肺炎克雷伯氏菌的宿主间传播主要发生在其肠道贮存器中，但具有免疫表型的小鼠显示出对人肠道微生物群的定殖的抗性，并且尚不清楚人源化免疫系统是否会改变人肠道微生物群的定殖模式。

3、因此，临床中亟需一种操作简便、价格低廉的小鼠模型用于模拟人类肠道菌群进行克雷伯氏菌相关的临床前验证的相关研究。

技术实现思路

1、根据不同小鼠肠道中的肠道菌群丰度及分群，阐明人类肠道菌群的克雷伯氏菌在小鼠肠道中的定殖模式，提供一种可用于模拟人类肠道菌群定殖的克雷伯氏菌相关小鼠应用模型，以解决现有技术中存在的因小鼠免疫应答与人类免疫应答不同而造成的肠道菌群差异，弥补可用于模拟克雷伯氏菌相关人类肠道菌群进行临床前验证的小鼠模型空白，同时解决人类肠道菌群采样困难，实验周期长，价格昂贵的问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、步骤1、构建人源化小鼠模型，检测人源免疫细胞在小鼠体内定殖情况；

5、步骤2、人源化小鼠的人类粪便菌群移植造模；

6、步骤3、根据人源化小鼠的人类粪便菌群移植动物模型评估肠道菌群中克雷伯氏菌丰度是否改变；

7、步骤4、利用实时荧光定量pcr探究人fmt后huncg小鼠肠道中克雷伯氏菌是否稳定定殖。

8、作为优选的一个方面，所述步骤1包括以下子步骤：

9、通过用120gy照射ncg小鼠幼仔并将cd34+hsc注射到肝脏中来产生人源化ncg小鼠；

10、检测人源免疫细胞在小鼠体内定殖情况。

11、作为优选的一个方面，所述步骤2包括以下子步骤：

12、将c57 bl 6/j、ncg和huncg小鼠分组；在饮用水中向小鼠施用广谱抗生素一周。

13、将来自中风患者的三个粪便样品合并并以100 mg/ml的比例溶解在无菌pbs中，涡旋混合物以彻底溶解；在4℃、800g离心3分钟后收集上清液；

14、通过连续三天经口灌胃使用10μl/g的上清液进行移植。

15、作为优选的一个方面，施用广谱抗生素一周的量为：氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑和0.35 mg/ml万古霉素各1mg/ml。

16、作为优选的一个方面，所述步骤3包括以下子步骤：

17、将粪便样品收集在试管中，并立即在液氮中冷冻以保存微生物dna；

18、使用试剂盒提取细菌基因组dna；

19、使用聚合酶链反应（pcr）扩增16srrnav3-v4区域；pcr扩增的引物为338f（5'-actcctacggaggcagcag-3'）和806r（5'ggactachvggggtwtctaat-3'）；

20、对扩增的dna片段进行测序；

21、预处理16srrna测序数据，进行质量过滤，并使用dada2工具生成特征表；

22、使用vsearch插件，以97%序列相似性阈值对操作分类单位（otu）进行分类；

23、使用fasttree插件，在使用mafft比对序列后创建系统发育树；采样深度为25443，利用q2多样性分析肠道微生物组的多样性；

24、使用picrust和16srrna序列，计算肠道微生物组的功能。

25、作为优选的一个方面，所述步骤4包括以下子步骤：

26、将粪便样品收集在试管中，并立即在液氮中冷冻以保存微生物rna；

27、使用fastpurecell/tissuetotalrnaisolationkitv2试剂盒提取细菌rna；

28、使用hiscriptiiqrtsupermixforqpcr(+gdnawiper)试剂盒对细菌rna进行反转录；

29、使用aceqqpcrsybrgreenmastermix试剂盒对细菌rna进行实时荧光定量pcr检验。

30、与现有的克雷伯氏菌动物模型相比，模拟人类肠道菌群定殖的克雷伯氏菌相关小鼠应用模型，可以解决现有技术中存在的因小鼠免疫应答与人类免疫应答不同而造成的肠道菌群差异，弥补了克雷伯氏菌在肠道菌群中进行临床前验证的小鼠模型空白，解决了解决人类肠道菌群采样困难，实验周期长，价格昂贵的问题。

技术特征：

1.一种利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤1包括以下子步骤：

3.如权利要求2所述的利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤2包括以下子步骤：

4.将来自中风患者的三个粪便样品合并并以100 mg/ml的比例溶解在无菌pbs中，涡旋混合物以彻底溶解；在4℃、800g离心3分钟后收集上清液；

5. 如权利要求1所述的利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法，其特征在于，施用广谱抗生素一周的量为：氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑和0.35 mg/ml万古霉素各1mg/ml。

6.如权利要求1所述的利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤3包括以下子步骤：

7.如权利要求1所述的利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法，其特征在于，所述步骤4包括以下子步骤：

技术总结本发明公开一种利用粪便移植技术构建克雷伯氏菌定植人源化小鼠模型的方法，包括以下步骤：步骤1、构建人源化小鼠模型，检测人源免疫细胞在小鼠体内定殖情况；步骤2、人源化小鼠的人类粪便菌群移植造模；步骤3、人源化小鼠的人类粪便菌群移植动物模型评估肠道菌群中克雷伯氏菌丰度是否改变；步骤4、实时荧光定量PCR探究人FMT后huNCG小鼠肠道中克雷伯氏菌是否稳定定殖。技术研发人员：陈仁金,李欣,杨帅,张贺,陈阳,张雨晨受保护的技术使用者：徐州医科大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13