DR-18和溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及dr-18和溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤，是威胁人类健康的第一大致死性疾病。《全球癌症报告》数据显示，2020年全球新发癌症1929万例，因癌症病死995万例(sung h,ferlay j,siegel r l,etal.global cancer statistics 2020:globocan estimates ofincidence and mortalityworldwide for 36cancers in 185countries[j].ca cancerjclin,2021,0:1-41.)。预计到2040年，全球新增癌症病例将达到2840万例，相比于2020年上升了47％，且发展程度低或中等的国家病例增幅最大，分别为95％和64％(曹毛毛，陈万青.globocan 2020全球癌症统计数据解读[j].中国医学前沿杂志(电子版),2021,13(3)：63-69.)。因此广大人民群众对高效、经济的抗肿瘤药物有着非常广泛的需求(wanqing chen,rongshou zheng,etal.cancer statistics in china,2015[j].ca cancerjclin,2016,6(6):115-132.)。

2、恶性肿瘤的传统治疗手段包括手术、放疗、化疗，在过去的几十年里取得了重大的进步，但依然无法实质性地改善患者的长期生存率，尤其是对肝癌、胶质瘤、胰腺癌、骨肉瘤等难治性肿瘤患者。细胞毒性药物和分子靶向药物现在作为临床一线抗肿瘤药物，分别存在毒副作用大和/或易产生耐药性的局限性。因此，恶性肿瘤的治疗亟需高效低毒的新型治疗手段和治疗药物。

3、目前，免疫疗法是极受关注的癌症治疗方法。免疫疗法不同于传统的手术、放疗、化疗和靶向药物的直接作用，它通过激活患者自身的免疫系统杀伤肿瘤，对正常组织影响小。免疫疗法对一部分晚期肿瘤仍然有效，甚至可以防止肿瘤复发，达到彻底治愈的效果。癌症免疫疗法目前已获美国食品药品监督管理局(fda)批准的临床使用药物种类包括：1.免疫检查点抑制剂，如pd-1抗体(nivolumab、pembrolizumab等)、pd-l1抗体(atezolizumab)和ctla4抗体(ipilimumab)；2.多个针对表面肿瘤相关抗原的单克隆抗体，如抗cd20的单克隆抗体利妥昔单抗等；3.两种免疫刺激细胞因子(干扰素ifn-α)和白介素2(il-2)；4.免疫原性细胞死亡诱导剂，如环磷酰胺、奥沙利铂等；5.过继嵌合抗原受体t细胞疗法(cart)；6.卡介苗(bcg)；7.树突状细胞为基础的癌症疫苗；8.溶瘤病毒(oncolyticvirus，ov)等。

4、溶瘤病毒疗法是一种靶向治疗、免疫治疗和基因治疗相结合的新型抗肿瘤免疫疗法，能够选择性感染并直接杀伤肿瘤细胞，进而通过暴露肿瘤/病毒抗原并释放细胞因子等机制激活抗肿瘤免疫应答从而直接或间接发挥抑瘤作用，另溶瘤病毒本身可以作为载体携带自杀基因，免疫调节基因，促凋亡基因，抗血管生成等基因进一步调控肿瘤微环境，促进抗肿瘤药效，和目前临床使用的常规治疗方法相比，溶瘤病毒疗法具有杀伤作用强，安全性高，成本较低等优势。

5、由于具有独特的多重抗肿瘤作用途径，众多团队学者致力于研究开发这种疗法，然而迄今为止仅有四个溶瘤病毒产品获得上市批准，应用于肿瘤的临床治疗中，包括2003年在拉脱维亚获批上市的rigvir、2005年在中国获批上市的安柯瑞(h101)，2015年在美国获批上市的imlygic(t-vec)，以及2021年在日本获批上市的delytact。此外，多种溶瘤病毒也处于临床试验阶段，以腺病毒(adv)、单纯疱疹病毒(hsv)和痘苗病毒(vv)临床应用最为广泛。

6、其中，痘苗病毒是一类研究较为充分的病毒，曾作为预防天花的疫苗，在世界范围内广泛地接种，至今已近200年历史，显示出良好的效果与安全性。因其致病风险较低、致病性与致病基因相对明确、减毒策略成熟、基因组稳定、不整合、不潜伏、溶瘤效应强烈、激活免疫应答、外源基因装载量大且表达稳定、可静脉给药等优点，已被广泛接受是理想的工程改造溶瘤病毒骨架之一。基于以上开发优势，目前国内外已开展了多项溶瘤痘苗病毒的临床试验，表现出良好的安全性和疗效，如jx-594已批准在中国进行iii期国际多中心临床试验。

7、虽然近几十年来，通过人工基因修饰改造的溶瘤痘苗病毒在肿瘤治疗领域取得很大进展，但目前仍未有一款治疗性溶瘤痘苗病毒产品成功获批上市，处于临床试验阶段的痘苗病毒株包括wr、lister、copenhagen、wyeth、lc16m0、mva等，人工基因修饰改造策略如：t601/tg6002采用copenhagen敲除tk、rr基因，加载fcu1基因；asp9801采用lc16m0敲除vgf、i1l和b5r基因，加载il-7，il-12基因；jx-594采用wyeth敲除tk基因，加载gm-csf基因等。溶瘤痘苗病毒对肿瘤杀伤作用的机制研究以及应用尚有很多进步的空间，如抗病毒抗体的消除或逃避、免疫治疗靶点的开发、溶瘤病毒与其他抗癌药物联合用药、给药途径及适应证范围等问题仍需加大研究。

8、il-18是一种激活免疫的细胞因子，可刺激t细胞、nk细胞和骨髓细胞，具有激活抗肿瘤免疫细胞的能力，因而可作为治疗癌症的候选分子。然而，肿瘤微环境中的il-18bp(il-18结合蛋白)可充当分泌型免疫检查点分子，竞争性结合il-18并阻断其与受体结合，限制了il-18免疫治疗的效果，使得免疫细胞无法激活抗肿瘤免疫应答。

技术实现思路

1、一方面，本发明提供了dr-18在制备与溶瘤痘苗病毒组合使用的抗肿瘤药物中的应用。

2、一方面，本发明提供了溶瘤痘苗病毒在制备与dr-18组合使用的抗肿瘤药物中的应用。

3、一方面，本发明提供了dr-18在制备溶瘤痘苗病毒抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂方面的应用。另一方面，本发明提供了溶瘤痘苗病毒在制备dr-18抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂方面的应用。

4、耐药逆转剂是指，当采用一些溶瘤病毒作为抗肿瘤药物用于治疗肿瘤时，存在着一些肿瘤对溶瘤病毒并不太敏感，或者说这些肿瘤对溶瘤病毒具有抗性，此时，可以采用与il-18(作为耐药逆转剂)联用溶瘤病毒的方式，以逆转肿瘤对所述溶瘤病毒的抗性；或者，反过来讲，当一些抗肿瘤物质用于治疗肿瘤时，存在着一些肿瘤对药物并不太敏感，或者说这些肿瘤对该物质具有抗性，此时，可以采用溶瘤病毒(作为耐药逆转剂)与这些物质联用的方式，以逆转肿瘤对所述物质的抗性。

5、dr-18，是一类突变的il-18，其结合并激活il-18受体及其下游通路，且不结合il-18bp。例如，美国专利公开号：2019/0070262；和zhou等人，nature(2020)583:609-614中，公开了一些人源dr-18、以及一些鼠源dr-18。

6、在一些实施方案中，所述的dr-18为人源dr-18；在一些实施方案中，所述人源dr-18相对于野生型人源il-18，包含至少一个突变。

7、在一些实施方案中，所述人源dr-18相对于野生型人源il-18包含以下突变中的一种或多种：m51k、k53s、q56l、p57a、m60l、s105d、d110s和n111r；在一些实施方案中，所述人源dr-18相对于野生型人源il-18包含以下突变：m51k、k53s、q56l、p57a、m60l、s105d、d110s和n111r；在一些实施方案中，所述人源dr-18的氨基酸序列如seq id no:1所示；在一些实施方案中，所述野生型人源il-18的氨基酸序列如seq id no:3所示。

8、在一些实施方案中，所述的dr-18为鼠源dr-18；在一些实施方案中，所述鼠源dr-18相对于野生型鼠源il-18，包含至少一个突变。

9、在一些实施方案中，所述鼠源dr-18相对于野生型鼠源il-18包含以下突变中的一种或多种：n1h、m50a、k52g、e55r、v56a和l59k；在一些实施方案中，所述鼠源dr-18相对于野生型鼠源il-18包含以下突变：n1h、m50a、k52g、e55r、v56a和l59k。

10、在一些实施方案中，所述鼠源dr-18的氨基酸序列如seq id no:2所示；在一些实施方案中，所述野生型鼠源il-18的氨基酸序列如seq id no:4所示。

11、在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒为tk基因功能缺陷型；在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒的tk基因失活、表达不足或缺失；在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒的tk基因缺失；在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒选自wr株、wyeth株、lister株、copenhagen株，和天坛株中的一种或多种；在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒选自wyeth株。

12、如本发明所用，“人源dr-18”与dr18可以互换使用；“鼠源dr-18”与“mdr18”可以互换使用。

13、如本发明所用，“突变”、“突变体”或“变体”是指相对于参考序列的核酸或多肽序列的改变(参考序列可以是天然存在的正常或“野生型”序列)，并且包括易位、缺失、插入和取代/点突变。本文中使用的“突变体”或“变体”是指包含突变的核酸或蛋白质。

14、如本发明所用，术语“野生型”是指从天然来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在人群中最常观察到的基因，因此被任意指定为该基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“变体”或“突变体”是指与野生型基因或基因产物相比，具有序列和/或功能特性修饰(即改变的特性)的基因或基因产物。

15、如本发明所用，在提及溶瘤病毒的基因时所使用的术语“功能缺陷”是指该溶瘤病毒无法发挥该基因应有的功能，即功能丧失，该目的可通过(例如)在基因中插入外源片段或敲除该基因而实现。

16、在一些实施方案中，可以在基因中插入外源核苷酸序列和/或敲除该基因，从而使其功能缺陷。

17、一方面，本发明提供了一种dr-18和溶瘤痘苗病毒组合以治疗肿瘤的技术方案。在一些实施方案中，所述“组合”做广义解释，例如，药物组合物、药品套装，以及在分子层面将dr-18基因与溶瘤痘苗病毒的基因组合。

18、一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的药物组合，包含：

19、dr-18，和

20、溶瘤痘苗病毒。

21、如本发明所用，术语“药物组合”表示将一种以上的活性成分混合或组合而得到的产物，包括活性成分的固定组合及非固定组合。如本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等意在囊括给单个患者施用选定的治疗药物，并且意在包括其中药物不一定通过相同施用途径或不一定在相同时间施用的治疗方案。

22、如本发明所用，术语“固定组合”表示以单一实体或剂量的形式给患者同时施用活性成分(例如溶瘤痘苗病毒及dr-18)。

23、如本发明所用，术语“非固定组合”表示活性成分(例如溶瘤痘苗病毒及dr-18)作为单独的实体同时、共同或没有具体时间限制地依次施用于患者，其中这种施用在体内可提供这两种化合物的治疗有效水平，优选在相同时间如此。例如，非固定组合可以是各自含有一种活性成分的两种胶囊，其目的是用两种活性成分一起在体内使患者得到治疗。

24、如本发明所用，“联用”或“联合使用”意指两种或更多种活性物质可以在混合物中一起、各自作为单一制剂同时地或各自作为单一制剂以任何顺序(例如同时、先后、间隔地)依次地施用于受试者。

25、如本发明所用，术语“药物组合”包括：将目的基因(在本技术中，例如dr18)重组到溶瘤痘苗病毒基因组中，从而得到的可以同时发挥溶瘤痘苗病毒和dr18药物活性的重组溶瘤痘苗病毒。

26、如本发明所用，术语“与……组合”在指给予对象多种试剂时，是指给予对象第一试剂至少一种其它(即第二、第三、第四、第五，等)试剂。如本发明所用，如果在给予第二试剂时，由于给予第一试剂而产生的生物学效应在对象体内持续，使第一试剂和第二试剂的治疗作用叠加，则认为一种试剂(如dr-18)与第二试剂(例如溶瘤痘苗病毒)组合给予。第一试剂(如dr-18)的给药在较长的时间内提供治疗作用，第二试剂(如溶瘤痘苗病毒)的给予在第一试剂的治疗作用仍在进行时提供其治疗作用，因此第二试剂被认为是与第一试剂组合给予，即使第一试剂可能是在离第二试剂给予时间很远的时间点(如几天或几周)进行的。在一些实施方式中，如果第一和第二试剂同时(在彼此的30分钟内)、同期或依次给予，则认为第一试剂与第二试剂组合给予。在一些实施方式中，如果第一试剂和第二试剂在彼此约24小时内(例如在彼此约12小时内，在彼此约6小时内，在彼此约2小时内，或在彼此约30分钟内)给予，则第一试剂被视为与第二试剂“同期”给予。术语“与……组合”也应理解为适用于第一试剂和第二试剂共同配制在单一药学上可接受的制剂中并将该共同制剂给予对象的情况。在一些实施方案中，dr-18和溶瘤痘苗病毒是依次给予或应用的，例如，在给予一种试剂后给予一个或多个其他试剂。在一些实施方案中，dr-18和溶瘤痘苗病毒同时给予，例如，在同一时间或大约同一时间给予两种或多种试剂；这两种或多种试剂可以存在于两种或多种分别的制剂中，或组合成单一制剂(即共同制剂)。无论这些试剂是依次或同时给予，如本发明所用，它们都被认为是组合给予/使用的。

27、在一些实施方案中，所述药物组合为药物组合物或药品套装；在一些实施方案中，所述药物组合物中包含dr-18和溶瘤痘苗病毒的混合物；在一些实施方案中，所述的药品套装包含独立包装的dr-18及独立包装的溶瘤痘苗病毒。在一些实施方案中，所述药物组合为基因组中插入dr-18核苷酸序列的重组溶瘤痘苗病毒。

28、一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，包含：

29、dr-18，和溶瘤痘苗病毒。

30、一方面，本发明提供了一种药品套装，包含：

31、dr-18，和溶瘤痘苗病毒。

32、在一些实施方式中，所述的药品套装包含独立包装的dr-18及独立包装的溶瘤痘苗病毒。

33、药品套装区别于组合物的地方在于，dr-18不同于溶瘤痘苗病毒的剂型，而是独立包装(例如：药丸、或胶囊、或药片或安剖瓶中，含有dr-18；另外的药丸、或胶囊、或药片或安剖瓶中，含有溶瘤痘苗病毒)。在一些实施例中，溶瘤痘苗病毒、dr-18，以及溶瘤痘苗病毒和dr-18的组合，也可含一种或多种佐剂。所述的佐剂是指在药物组成中，可辅助药物疗效的成分。药品套装也可以包含独立包装的dr-18，以及独立包装的溶瘤痘苗病毒。药物套装中dr-18，以及溶瘤痘苗病毒的施用，可以是同时施用或者是以任意的前后顺序施用，例如在溶瘤痘苗病毒之前施用dr-18，或者在溶瘤痘苗病毒之后施用dr-18，或者两者同时施用。在各种实施例中，患者可以是哺乳动物。

34、在一些实施方式中，所述的组合物/药品套装还包含药学上可接受的载体。

35、在一些实施方式中，所述的dr-18与溶瘤痘苗病毒的配比为：0.01-200mg：103-109pfu；优选为0.1-200mg：104-109pfu；优选为0.1-100：105-109pfu。

36、在一些实施方式中，使用剂量为：dr-18的使用剂量范围为0.01-10mg/kg，同时溶瘤痘苗病毒的使用滴度为moi 103-109pfu/kg；优选为dr-18的使用剂量范围为0.1-5mg/kg，同时溶瘤痘苗病毒的使用滴度为moi 104-109pfu/kg；优选为dr-18的使用剂量范围为0.05-0.5mg/kg，同时溶瘤痘苗病毒的使用滴度为moi 105-109pfu/kg。

37、在一些实施方式中，所述药物的剂型包括注射剂、片剂、胶囊或贴剂；在一些实施方式中，所述药物的剂型为腹腔注射剂、瘤内注射剂或静脉注射剂。

38、在一些实施方式中，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。

39、在一些实施方式中，所述实体瘤选自肠癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、肺癌、肉骨瘤或胃癌中的一种或多种。

40、一方面，本发明提供了dr-18在制备抗肿瘤的药物组合中的应用，所述药物组合包含与dr-18组合的溶瘤痘苗病毒。

41、一方面，本发明提供了溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤的药物组合中的应用，所述药物组合包含与溶瘤痘苗病毒组合的dr-18。

42、一方面，本发明提供了所述药物组合/药物组合物/药品套装在制备抗肿瘤药物中的应用。

43、一方面，本发明提供了一种重组溶瘤痘苗病毒，所述重组溶瘤痘苗病毒基因组中包含：突变的溶瘤痘苗病毒序列，和dr-18序列。

44、在一些实施方式中，所述突变为tk基因功能缺陷；在一些实施方式中，所述突变为tk基因失活、表达不足或缺失；在一些实施方式中，所述突变为tk基因缺失；在一些实施方式中，所述的dr-18序列为为人源dr-18序列和/或鼠源dr-18序列。

45、在一些实施方式中，所述人源dr-18的核苷酸序列如seq id no:5所示。

46、在一些实施方式中，所述鼠源dr-18的核苷酸序列如seq id no:6所示。

47、一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括所述的重组溶瘤痘苗病毒，及药学上可接受的载体。

48、在一些实施方式中，所述药物组合物包含104-106pfu的所述重组溶瘤痘苗病毒；在一些实施方式中，所述药物组合物包含104-105pfu的所述重组溶瘤痘苗病毒；在一些实施方式中，所述药物组合物包含105-106pfu的所述重组溶瘤痘苗病毒。

49、本发明还提供了所述的重组溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

50、在一些实施例中，在将一些溶瘤病毒与dr-18的联用时，出现了难以预见的各异的效果，发明人发现了其中一些存在明显的相互拮抗或抑制现象，然而与这些现象不同的是，痘苗病毒与dr-18的联用在多种肿瘤的测试中显现明显的协同增效的作用，这是令人惊喜且带来良好开发前景期望的发现。