一种具有巨噬细胞靶向功能的抗生素重组脂蛋白载体的制作方法

本发明属于医药，具体涉及一种具有巨噬细胞靶向功能的抗生素重组脂蛋白载体。

背景技术：

1、耐药菌感染已经成为当今世界上最大的公共卫生问题之一，导致细菌产生耐药性的因素极其复杂，一方面是由于细菌自身基因结构的进化；另一方面，可能是由于为了治疗疾病所采用的大剂量或者不合理用药方式。随着人们的深入研究，亚抑菌浓度(sub-mic)导致的耐药问题引起了越来越多学者的关注。sub-mic指低于最低抑菌浓度(mic)的抗菌药物浓度，由于细菌长时间暴露在亚抑菌浓度的抗生素环境中，导致抗生素对细菌的选择压力增加，从而显著增加了细菌的耐药突变频率，耐药基因的表达和水平基因的转移等。细菌在体内处于亚抑菌浓度环境主要是由于：①药物在体内的广泛分布：抗生素的非特异性分布导致其部分积累于正常组织，而使感染部位的抗生素浓度低于mic，这主要是受到药物理化性质，器官血流量，组织结合率等因素的影响。②胞内浓度低：许多药物很难进入感染细胞，致使胞内抗生素浓度低，使之前有效剂量成为了mic以下的无效剂量。

2、而细胞内细菌感染与许多严重感染疾病相关，如肺结核、心内膜炎、骨髓炎、坏死性肺炎和脓毒症等。巨噬细胞是吞噬和杀伤细菌的关键固有免疫细胞，发挥抑制和化解感染的“看门人”作用。细菌为了生存，则进化出了表面分子伪装、激活宿主代谢抵抗和抑制免疫系统等多种防御策略，在巨噬细胞内寄居并聚集，使其从“看门人”转变为细菌抵御抗生素和免疫反应的“庇护所”。传统上，常采用高剂量抗生素给药以消灭胞内菌和限制sub-mic引起的耐药问题。然而，许多抗生素(例如氯霉素)在高剂量治疗时可能导致危险的副作用，如过敏反应、再生障碍性贫血和肠道菌群失调等。因此，将抗生素靶向递送到受感染的巨噬细胞中对于最大限度地提高抗菌效果，限制耐药性和减少毒副作用至关重要。

3、但是，大部分抗生素具有亲脂性，存在生物利用度较差、个体内和个体间变异性高及缺乏剂量比例性等问题。解决方案之一是将亲脂性抗生素封装在含有由甘油单酯、甘油三酯和蜡组成的凝胶相疏水核心的固体脂质纳米颗粒(sln)中。然而，由于sln的结晶脂质基质，这些颗粒容易发生凝血，并且sln通过内吞入胞的方式将药物递送至受感染的巨噬细胞内部，这种靶向作用是被动的，效率较低。

4、血浆中存在一种天然的疏水分子转运体，即高密度脂蛋白(hdl)，其主要由载脂蛋白和疏水脂质核心组成，在体内主要发挥转运胆固醇等疏水分子的作用。hdl的靶向性受体——清道夫受体b类1型(sr-b1)，存在于多种巨噬细胞类型(如肝脏驻留的枯否细胞、肺泡巨噬细胞)中，并能主动内化封装在hdl核心中的疏水分子。并且由于hdl具有较大的脂质核心、生物可降解性以及不被网状内皮系统识别和清除的特性，使重组hdl(rhdl)可作为药物载体，在提高药物靶向性和增加药效等方便表现出独特的优势。例如，cn202280006484.3利用载脂蛋白e(apoe)构建rhdl用于脑靶向预防或治疗神经退行性疾病；cn116509819a利用载脂蛋白a-i(apoa-i)构建了一种双载药rhdl，提高了药物的抗结肠癌效果。因此，rhdl可作为靶向和递送抗生素至感染巨噬细胞的可行选择。

5、然而上述发明均使用人源性载脂蛋白。目前，人血是rhdl载脂蛋白的主要来源，但从血浆中分离载脂蛋白存在许多问题，如血浆来源有限，不易大规模生产、分离纯度较低，容易掺杂非目标载脂蛋白、易受内毒素等内源性物质污染等。本发明通过固相多肽合成法能够方便迅速地合成大量apoa-i模拟肽，模拟肽保留了人源性载脂蛋白关键的二级螺旋样结构，具有与之相似的功能，并且生产成本较低，纯度较高；此外，apoa-i模拟肽相较于人源性apoa-i具有更强的靶向效果。

6、因此，有必要制备一种负载抗生素的重组脂蛋白载体，将抗生素靶向递送至受感染的巨噬细胞，提高胞内抗生素浓度，减少非特异性分布，从而提高抗生素药效、限制耐药性产生和减少毒副作用，解决巨噬细胞胞内感染问题。

技术实现思路

1、要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种具有巨噬细胞靶向功能的抗生素重组脂蛋白载体，采用薄膜分散法将抗生素，磷脂和胆固醇溶解于有机相中，形成磷脂膜；再在水相中加入表面活性剂，与磷脂膜混合，形成透明的脂质混悬液，将混悬液与载脂蛋白模拟肽孵育，透析除去表面活性剂；制得的负载抗生素的重组脂蛋白载体，将抗生素靶向递送至受感染的巨噬细胞，提高胞内抗生素浓度，减少非特异性分布，从而提高抗生素药效、限制耐药性产生和减少毒副作用，解决巨噬细胞胞内感染问题。

2、技术方案：一种具有巨噬细胞靶向功能的抗生素重组脂蛋白载体，具体包括以下组分：抗生素，磷脂，胆固醇，表面活性剂和载脂蛋白模拟肽。

3、进一步的，所述抗生素，磷脂，胆固醇，表面活性剂和载脂蛋白模拟肽的摩尔比为(5％～25％):(25％～55％):(1％～10％):(1％～5％):(10％～50％)。

4、进一步的，所述抗生素为脂溶性抗生素或两亲性抗生素；所述脂溶性抗生素包括氯霉素、左氧氟沙星；所述两亲性抗生素包括四环素。

5、进一步的，所述磷脂为大豆磷脂、蛋黄磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬质酰磷脂酸胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬质酰磷脂酰甘油中的任意一种或多种。

6、进一步的，所述表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、胆酸钠和去氧胆酸钠。

7、进一步的，所述载脂蛋白模拟肽主要模拟天然高密度脂蛋白上的载脂蛋白成分，为模拟肽apoa-i、apoa-ii、apoe、apod中的任意一种或多种。

8、进一步的，所述模拟肽apoa-i序列为dwlkafydkvaeklkeaf、ac-faekfkeavkdyfakfwd-oh、h-pvldlfrellnellealkqklk-oh；所述模拟肽apoe序列为ac-lrvrlashlrklrkrll-nh2。

9、进一步的，具体制备步骤如下：

10、s1.将抗生素、磷脂和胆固醇溶于有机相中，完全溶解后，在旋转蒸发仪上减压蒸发得到磷脂膜；

11、s2.在水相中加入表面活性剂，再加入磷脂膜，采用薄膜分散法或乳化蒸发法制备得到脂质混悬液；

12、s3.将脂质混悬液与载脂蛋白模拟肽于4～37℃孵育4～24h，透析除去表面活性剂，即得抗生素重组脂蛋白载体。

13、进一步的，所述步骤s1中有机相包括乙醇、甲醇和氯仿。

14、进一步的，所述抗生素重组脂蛋白载体平均粒径为10～200nm。

15、有益效果：

16、1.本发明采用固相多肽合成法能够方便迅速地合成大量apoa-i模拟肽，模拟肽保留了人源性载脂蛋白关键的二级螺旋样结构，具有与其相似的功能，并且生产成本较低，纯度较高；此外，apoa-i模拟肽相较于人源性apoa-i具有更强的靶向效果；

17、2.本发明制备的重组高密度脂蛋白(rhdl)，平均粒径～40nm，包封率>80％，通过透析法测得载药量>4％，zeta电位<-20mv，稳定性良好，能够利用靶向性受体——清道夫受体b类1型(sr-b1)更好地将抗生素靶向递送至巨噬细胞内，杀灭胞内菌；

18、3.本发明制备的一种负载抗生素的重组脂蛋白载体，抗生素被包裹在高密度脂蛋白核心，并且能够将抗生素靶向递送至受感染的巨噬细胞，提高胞内抗生素浓度，减少非特异性分布，从而提高抗生素药效、限制耐药性产生和减少毒副作用，解决巨噬细胞胞内感染问题。