用于预防和/或治疗纤维化自免疫或炎性肺病的可吸入蛋白酶抑制剂

本技术涉及涉及一种根据式(i)的化合物或其盐、溶剂化物、和/或水合物，其中该化合物抑制半胱氨酸蛋白酶，可用于治疗和预防炎性和/或纤维化肺病，其中该化合物以优选包含乙醇作为载体的药物组合物经吸入而施用。

背景技术：

1、在多种肺部炎性多系统疾病中，炎症造成对肺部组织的初步损伤(急性肺部损伤)，其引起渐进性的破坏，并最终引起肺纤维化、呼吸衰竭死亡。当前没有有效彻底阻止肺部不可逆重塑进程的药物。

2、在多种蛋白酶类型中，越来越多的证据表明，半胱氨酸组织蛋白酶参与在肺稳态中[1]。尽管它们的确切功能仍有待明确，组织蛋白酶是有效的ecm降解酶[2]。这些酶属于c1家族(人类基因组有11种半胱氨酸组织蛋白酶：组织蛋白酶b、h、l、s、c、k、o、f、v、x和w[3、4])，并长久以来被认为主要参与在内吞蛋白的溶酶体终末阶段降解中。

3、组织蛋白酶在细胞内位于细胞的胞内体/溶酶体中，主要在酸性ph环境下作用。通过加工和释放蛋白，组织蛋白酶调节炎性介质和酶的活化和释放[6-10]。组织蛋白酶在所有以下疾病(影响肺部并引起肺部组织重塑直至肺纤维化(作为共同主线)的自免疫疾病和间质性肺病、系统性硬化症、慢性过敏性肺炎、特发性肺纤维化、结节病、闭塞性细支气管炎综合征(bos)/移植物抗宿主病、肺移植后慢性移植物衰竭、支气管哮喘、copd和肺气肿、检查点抑制剂诱发的肺炎、囊性纤维化、淋巴管平滑肌增生症)[11][11、10]以及ards(包括sars-cov-2或流感病毒引发的ards)[1、5-8、10-42]中显示出对于重塑这一共同结局的抵抗作用。

4、蛋白酶抑制剂阿洛司他丁(别名：e64d；est；伊斯坦特(estate)；洛司他丁(loxistatin)；瑞酰司他丁(rexostatine))是合成的e 64类似物，e 64是得自真菌的天然产物。e64d是e64c的乙酯，且在经肠系膜渗透过程中(即，在经口摄入后)水解回作为更加有效形式的e64c。阿洛司他丁的化学通式如下所示：

5、

6、从化学上而言，e64d是l-亮氨酸衍生物，其是通过(2s,3s)-3-(乙氧基羰基)环氧乙烷-2-羧酸的羧基的羧基与n-(3-甲基丁基)-l-亮氨酰胺的氨基的正式缩合而获得的酰胺。因而，其是l-亮氨酸衍生物、单羧酸酰胺、环氧化物和乙酯。e64d是半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶b和l的抑制剂，也被认为可抑制钙蛋白酶。

7、e64d最初被开发用于治疗肌营养不良，但是在人临床试验中未获成功，尽管在治疗脊髓损伤、中风和阿尔茨海默病方面的研究在持续。e64d还被描述为具有一些抗病毒效果[43]。

8、wo2012112363涉及作为组织蛋白酶k抑制剂的氘化化合物，其可用于治疗涉及骨吸收被抑制的疾病，例如骨质疏松[44]。

9、[44]研究了组织蛋白酶k(catk)在小鼠肺纤维化病理中的假定作用及其与人疾病活动的关联。

10、对于阻止任何实体的各种急性和慢性炎性疾病的致死性过程有着非常迫切的医疗需求，这些疾病起始于急性肺损伤(ali)，引起肺部组织的不可逆重塑，直至终末的组织纤维化，导致患者的死亡。根据我们自己的研究结果，e64d具有防止任何实体(不管是病毒、细菌、自免疫、有害的)的急性肺损伤、从而防止对于肺部组织的不可逆损伤的医疗潜力。随着e64d在肺部的有效局部沉积，肺组织的终末重塑过程应当可避免需要肺移植的严重缺氧。否则，患者常常会因呼吸衰竭而死亡。通过在这些就像以常见菌株引起急性肺部损伤为起始并引起肺组织不可逆重塑的不同肺部疾病中抑制半胱氨酸蛋白酶，应当可以避免这些患者的过早死亡。当研究本技术的当前说明书时，其他目的和有利之处对于本领域技术人员而言将变得明晰。

技术实现思路

1、在本技术的第一个方面，该目的通过根据式(i)的化合物(阿洛司他丁，e64d；est；伊斯坦特；洛司他丁；瑞酰司他丁)，其生理上可接受的盐、溶剂化物或水合物而实现，其用于在哺乳动物受试者例如人中预防和/或治疗炎性和/或其他纤维化肺病，其中该化合物，其生理上可接受的盐、溶剂化物或水合物作为包含合适溶剂作为载体的药物组合物经吸入而施用。

2、

3、在本技术的背景下，不仅显示出有效成分e64d针对肺组织重塑的抗炎性和抗纤维化特性，而且在covid-19中有直接的抗病毒效果。在临床前实验中，e64d显示出，抑制病毒进入sars-cov-2感染的细胞系。

4、根据式i的化合物(阿洛司他丁，e64d；est；伊斯坦特；洛司他丁；瑞酰司他丁)可下调由不同疾病实体引起的炎症，且应当可防止终结于不可逆纤维化重塑的当前炎性通路(我们自己的临床前实验显示出在体外的抗炎症和抗纤维化作用)。在自己当前使用大鼠的临床前实验中，e64d在吸入肺部时显示出较低的毒性作用。根据本技术的优选方面，e64d经吸入来防止疾病朝更严重的阶段发展。吸入e64d，因为经口施用引起阿洛司他丁(e64d)的失活。经口施用时，e64d被无处不在的酯酶切割成其酸形式，洛司他丁(e64c)。由于仅有作为亲脂前药的酯化合物阿洛司他丁可以通过细胞膜，并阻断胞内组织蛋白酶，在可以经吸入实现的绕过胃肠道时可确保更高的药物效率。此外，使用吸入的局部施用，比起经口喂食，引起更高的局部沉积。

5、在本技术的背景下，发现底物e64d抑制中性粒细胞从血管迁移至肺组织。中性粒细胞是炎性细胞，在肺组织中释放组织降解酶。中性粒细胞从血管经血管壁进入肺组织的趋化迁移，由促炎性介质例如白介素-8、白介素-17和金属蛋白酶-19介导。白介素-8和金属蛋白酶-19的释放发生在肺泡上皮细胞和血管内皮细胞，且在这些细胞被病毒感染和/或与细菌相互作用和/或受到环境影响例如细微灰尘沉积或物理刺激如电离辐射时而激发。

6、另一方面，il-17从th17细胞释放而来。血液和肺组织中t淋巴细胞分化为th17细胞，发生在自免疫疾病(称为胶原病)、肉芽肿性疾病(例如结节病)、肺移植后的排斥反应、移植物抗宿主病背景下的闭塞性细支气管炎综合征、系统性硬化症、过敏性肺炎、th17相关的中性粒细胞性支气管哮喘、以及成人呼吸窘迫综合征(ards)(特别是covid-19相关ards)中。th17细胞分泌il-17，其将血管中的中性粒细胞招募至肺组织，经中性粒细胞释放的侵袭性肺组织破坏酶，引起急性肺损伤。这些酶使得炎症持续化，并招募其他炎性效应细胞，包括释放额外促炎性介质的th1-和th17-淋巴细胞。这些介质促成所谓的“急性期反应”，引起水肿、血管通透性增加和渗出。这些介质-特别是il-17-是招募肺成纤维细胞的化学诱导剂。当前的发明人，在他们的临床前体外实验中，显示出e64d抑制肺上皮细胞(a549)释放il-8和金属蛋白酶。而且，证据表明，e64d抑制t淋巴细胞分化成th17细胞。e64d抑制th17细胞释放促炎性il-17。在初步实验中，显示出e64d能够通过抑制il-17诱导的纤维细胞的增殖和分化而抑制il-17诱导的组织创伤。而且，预期e64d对成纤维细胞释放tgf-β(另一造成肺组织纤维化进展的介质)有抑制性作用。发明人能够示出e64d在体外抑制肺上皮细胞的胶原蛋白释放。胶原蛋白在肺实质组织最终重塑为完全纤维化中起关键作用。

7、迄今为止，用于其他疾病的口服组织蛋白酶抑制剂已经是临床测试的目标物。这些抑制剂仅抑制大量已有组织蛋白酶中的一种。迄今，口服施用的组织蛋白酶b或组织蛋白酶c抑制剂还未在临床试验中显示出好的疗效。一些组织蛋白酶(其中一些还具有冗余的作用机制)的全身性抑制，在之前被认为太过危险，因为组织蛋白酶还有着重要的生理特性，例如巨噬细胞mhc ii复合物的抗原提呈。除广谱组织蛋白酶抑制剂的可怕全身性作用外，药学上的挑战是，没有稳定的口服类广谱组织蛋白酶抑制剂。当前发明克服了这些问题。

8、e64d的吸入性施用的一个好处是，局部施用，直接使组织靶标细胞中的物质失活，防止广谱性组织蛋白酶抑制剂e64d(组织蛋白酶b、h、k、l和s的抑制)的危险性全身性作用。此外，由于在肺部的局部沉积，也绕开了肠道和血液中酯酶对物质的失活。

9、预期经由同时抑制多个协同作用的组织蛋白酶，可以达到高效得多的抗炎性、抗病毒和抗纤维化作用。同时抑制不同组织蛋白酶，使得可以经由不同的病理机制治疗一些引起急性肺损伤以及之后肺组织的慢性炎症包括最终纤维化的疾病实体。当前的发明提供这些有利之处。

10、使用之前临床测试且经口/全身施用的仅抑制单个组织蛋白酶的物质，无法治疗包括/引起急性和慢性炎症且带有肺组织纤维化的多种疾病实体和病症，本技术现在提供用于广泛的引起最终肺重塑的疾病的可吸入广谱作用组织蛋白酶抑制剂e64d。

11、在本技术的背景下，术语“阿洛司他丁”或“e64d”将包括处于生理学上可接受的盐形式的式i化合物，例如钙、钾、镁、胆碱或钠盐。术语还包括生理上可接受的溶剂化物和水合物。作为前药，其也包括e64c，其在经肠膜渗透后(即，在口服后)似乎是更加有活性的形式。e64c的化学式如下所示：

12、

13、根据本技术，“炎性和/或其他纤维化肺病”是包括引起肺组织渐进式破坏并涉及引起肺纤维化的不可逆重塑过程的初始肺组织损伤的肺部疾病或病症。因而优选本技术化合物的用途，其中该炎性和/或其他纤维化肺病是间质性和/或瘤性自免疫肺病、和/或该预防和/或治疗是针对病症中的恶化或严重炎症，和/或抑制il-17引起的肺组织损伤，优选地避免不可逆的气道重塑直至最终肺纤维化。

14、此外优选的是本技术化合物的用途，其中该用途排除对由选自β冠状病毒如hcov-oc43、sars-cov-1、hcov-hku1、mers-cov或sars-cov-2和/或其g614变体的病毒引起的病毒感染的治疗或预防。

15、根据本技术，优选的是根据本技术用途的化合物，其中该用途(实质上或完全)避免e64d在进入靶标肺上皮细胞之前转化为e64c，这是当前治疗策略的主要不利之处。

16、根据本技术，优选的是根据本技术用途的化合物，其中该用途包括>99％的累积活性化合物(e64d)沉积，粒径分布在约0.5-3μm范围内，在用于喷雾器的溶液中的浓度在0.34mg/ml和34mg/ml之间。

17、根据本技术，优选的是根据本技术用途的化合物，其中该化合物附于或结合于合适的固态载体，例如合适的多孔颗粒。各颗粒，尤其对于吸入组合物而言，为本领域技术人员所知，例如多孔颗粒共混悬液(peral technologies，us)。也可参见el-sherbiny et al.(inhaled nano-and microparticles for drug delivery.glob cardiol scipract.2015mar31；2015:2.doi:10.5339/gcsp.2015.2.pmid:26779496；pmcid:pmc4386009)，以及其中引用的文献。

18、根据本技术，哺乳动物受试者或患者可以优选地选自小鼠、大鼠、猫、狗、兔、山羊、绵羊、马、骆驼、羊驼、牛、猴、农场动物、竞技动物、和宠物，以及人。

19、根据本技术，化合物优选地用于在哺乳动物受试者中预防和/或治疗炎性和/或其他纤维化肺病，其可选自可与肺组织纤维化相关的急性或慢性肺组织炎症，例如特发性肺纤维化(ipf)、非特异性间质性肺炎(nsip)；急性间质性肺炎(aip)、淋巴样间质性肺炎(lip)、呼吸性细支气管炎伴间质性肺病(rb-ild)、组织细胞增多症、纤维化自身免疫性疾病、系统性硬化症、伴有肺纤维化受累的类风湿性关节炎、支气管哮喘(特别是th1-和/或th2和/或th17相关支气管哮喘)、干燥综合征、抗核抗体(ana)和抗中性粒细胞胞浆抗体(anca)相关血管炎、累及肺纤维化的红斑狼疮、过敏性肺炎、肉芽肿性多血管炎、嗜酸性肉芽肿病和多血管炎、结节病、铍病、囊性纤维化、检查点抑制剂诱发的肺炎、放射引发的肺炎、移植物抗宿主病、闭塞性细支气管炎综合征、慢性肺同种异体移植功能障碍、igg4相关肺部疾病、淋巴管平滑肌增生症、肺部淀粉样变性，得自肺癌、乳腺癌、结肠癌或肾细胞癌的肺转移，慢性阻塞性肺疾病(copd)、肺气肿、和严重病毒和细菌肺炎患者中的急性呼吸窘迫综合征(ards)。

20、“治疗”或“医治”是指对哺乳动物疾病或病症的任何治疗，包括，预防或免受疾病或病症，即，使得疾病的临床症状不发展；抑制疾病，即，使得临床症状发展停滞或受到压制；和/或减轻疾病，即，使得临床症状消退。“改善”是指预防、减轻或缓和受试者的状态，或改善状态；改善压力是指对抗负面的压力。改善包括但不需要完全康复或完全防止压力。

21、在关于化合物用途的本技术另一重要方面，该预防和/或治疗与另一合适的抗炎性和/或抗感染疗法组合，例如选自至少一种瑞德西韦、干扰素α2a或2b(不包括任何聚乙二醇化变体)、氯喹或羟氯喹、丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、和/或ii型跨膜蛋白酶(tmprss2)抑制剂(特别是卡莫司他((4-{2-[2-(二甲基氨基)-2-氧代乙氧基]-2-氧代乙基}苯基)(4-胍基苯甲酸酯))、可吸入皮质类固醇、血管活性肠肽(vip)和弗林蛋白酶抑制剂。

22、该用途的化合物作为供吸入的合适药物组合物提供和/或施用，例如干粉吸入剂或其他吸入形式。这些配方可以包含合适量的赋形剂和其他成分。组合的化合物以合适药物组合物进行提供，例如片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、粉剂、囊剂、可重构粉剂、干粉吸入剂，吸入、和/或可咀嚼的。优选为吸入。

23、因而，本技术用途的化合物可以单独使用，或与其他活性化合物(例如上述化合物)组合使用，其中在后一种情况下，观察到有利的加成、放大或优选为协同的效果。施用至人的合适量为1-500mg，特别是5mg-100mg，例如1-10mg/kg/天e64d剂量。细胞水平达到的有效浓度可以设置为50-200μm，优选为约100μm。对于局部施用，例如经吸入到达气道，剂量可以方便地减少至0.1-10mg/剂次，优选为0.2-5mg每剂次，其对于70kg受试者而言等于每千克约3-约80μg。

24、在本技术的背景下，有效吸入还需要存在合适的溶剂。选择并非小事，因为对于有效吸入，需要药物不沉淀，而存在于溶液中。由于化合物的亲脂特性，液态制剂只能使用有机溶剂。优选地，醇类可用作合适的溶剂，当前发明人发现，乙醇，其本身具有消毒和抗病毒效果，被证明是合适的，e64d溶解度高达68mg/ml(198.58mm)。此外，乙醇可以以纯化/gmp级质量获得，且被批准用作人用添加剂。本领域技术人员可以识别出适于本技术目的的各浓度。

25、应当理解的是，当前的化合物和/或包含当前化合物的药物组合物，用于人患者的给药。术语“施用/给药”是指将单独的治疗剂或与另一治疗剂组合进行给药。因而设想在联合疗法途径中，即，在与其他药物或药和/或任何其他可能在本技术方法背景下有利的治疗剂共施用中，采用本技术的药物组合物。然而，其他药物或药和/或任何其他治疗剂可以与本技术用途的化合物分开施用，如果需要的话，如果它们与当前用途的化合物共同(即，直接地和/或间接地，优选为协同地)作用。

26、在本技术的背景下，有效吸入还需要选择雾化和吸入的合适量、以及得到的药物浓度，这一方面在所有呼吸道部分(鼻咽，上、中呼吸道，和肺泡表面)提供充分量。另一方面，必须考虑乙醇吸入的医学限制，且必须避免沉淀。本领域技术人员可以识别出适合本技术目的的各容量和浓度。同时，患者依从性很重要，考虑到进行性疾病情况中呼吸的难度。

27、本技术的另一重要方面是对吸入技术的选择。优选的技术应当避免吸入过程中的药物损耗，以及同时确保在呼吸系统所有靶向部分的充足量。优选的是使用现代喷雾器例如nebu-tec的剂量+(nebu-tec，elsenfeld，germany)的吸入，因为该吸入设备使得可以进行呼吸触发的吸入，而不会有有效成分损耗至环境。吸入设备应当确保给药沉积在肺部。有效成分剂量、溶解度和粒径，以及吸入阿洛司他丁的肺部沉积的数据，可以使用常见撞击测试获得并进行控制。

28、所用的药物组合物可以任选地包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体或赋形剂，包括稀释剂(填充剂、膨胀剂，例如乳糖、微晶纤维素)、崩解剂(例如羧甲淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠)、粘合剂(例如pvp、hpmc)、润滑剂(例如硬脂酸镁)、助流剂(例如胶体sio2)、溶剂/助溶剂(例如水性媒介物、丙二醇、甘油、酒精)、缓冲剂(例如柠檬酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐)、防腐剂(例如苯甲酸钠、对羟基苯甲酸(me、pr和bu)、bkc)、抗氧化剂(例如bht、bha、抗坏血酸)、润湿剂(例如聚山梨醇酯、脱水山梨醇酯)、增稠剂(例如甲基纤维素或羟乙基纤维素)、甜味剂(例如山梨糖醇、糖精、阿斯巴甜、安赛蜜)、矫味剂(例如薄荷、柠檬油、奶油糖等)、保湿剂(例如丙烯、乙二醇、甘油、山梨糖醇)。其他合适的药学上可接受的赋形剂还记载于remington's pharmaceutical sciences,15th ed.,mack publishing co.,newjersey(1991)和bauer et al.,pharmazeutische technologie,5th ed.,govi-verlagfrankfurt(1997)。本领域技术人员知道适合e64d的配方，将能够方便地选择合适的药学上可接受的载体或赋形剂，基于例如药物组合物的配方和施用途径。

29、本技术的另一重要方面是对于合适粒径的选择，其在空气动力学上适当地到达呼吸系统所有靶向部分(参见以上)，而同时确保满足剂量沉积。本领域技术人员可以识别出适合于本技术目的的各尺寸和颗粒(参见，对于颗粒，例如el-sherbiny,ibrahim m et al.“inhaled nano-and microparticles for drug delivery.”global cardiologyscience&practice vol.2015 2.31mar.2015,doi:10.5339/gcsp.2015.2)。合适的平均颗粒直径大小在约2-约7μm，优选为约3-约5μm，最优选0.5-3μm(也可参见实施例和以下)。

30、在本技术的背景下，术语“约”是指给定值的+/-10％，除非另外指出。

31、除上述本技术用途的化合物外，药物组合物可以包含其他常用的、通常为惰性的载体材料或赋形剂。因而，药物组合物还可以包含添加剂，例如填料、稀释剂、崩解剂、粘合剂、助流剂、润湿剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、矫味剂或芳香剂、缓冲物质、和另外的溶剂或增溶剂或用于实现储库效果的试剂、以及用于改变渗透压的盐、包衣剂或抗氧化剂。它们还可以包含两种或多种本技术用途化合物的上述盐，以及上述的其他治疗上有活性的物质。

32、优选的是本技术用途的化合物，其中该化合物以有效剂量施用至受试者。该剂量可以在较宽范围内变动，且适用于各病例的个体情况。对于上述用途，合适的剂量将根据施用模式(此处为吸入)、要治疗的具体病症、和所需的效果而变动。然而，总体来说，在上述剂量率，例如约1-100mg/kg动物体重，特别是1-50mg/kg，实现了满意的结果。对于更大动物例如人的合适剂量率在约5mg-3g/天的量级，方便地施用一次或分开给药，例如一天2-4次，优选一天3次，或以缓释形式。总的来说，在经口施用的情况下，每个人约10mg-100mg，特别是10-50mg的日剂量是合适的。细胞水平达到的有效浓度可以设置在50-200μm，优选为约100μm。特别优选的是局部施用，例如经吸入到达气道。在这些情况下，剂量可以方便地减少至0.1-10mg/剂次，优选0.2-5mg每剂次，对于70kg受试者等于约3-约80μg每千克。

33、其另一方面，本技术提供在哺乳动物受试者例如人中预防和/或治疗炎性和/或其他纤维化肺病的方法，包括对该哺乳动物施用有效量的式(i)化合物、其生理上可接受的盐、溶剂化物或水合物，其中该化合物作为药物组合物，优选包含醇类例如乙醇为载体，经吸入而施用。

34、

35、优选的是根据本技术的方法，其中该炎性和/或其他纤维化肺病是间质性和/或瘤性自免疫肺病，和/或该预防和/或治疗针对该病症的恶化或严重炎症，和/或抑制il-17引发的肺组织的损伤，优选避免不可逆的气道重塑直至最终肺纤维化。

36、根据本技术，优选的是根据本技术的方法，其中化合物附于或结合于合适的固态载体，例如合适的多孔颗粒。各个颗粒，特别对于吸入组合物而言，为本领域技术人员所知，例如多孔颗粒共混悬液(peral technologies，us)。

37、另一优选的是根据本技术的方法，其中该疾病或病症选自肺纤维化，例如ipf、nsip；aip、lip、rb-ild、组织细胞增多症、纤维化自免疫疾病、系统性硬化症、累及肺纤维化的类风湿性关节炎、支气管哮喘(特别是th1-和/或th2和/或th17相关支气管哮喘)、干燥综合征、ana和anca相关血管炎、累及肺纤维化的红斑狼疮、过敏性肺炎、肉芽肿性多血管炎、嗜酸性肉芽肿病和多血管炎、结节病、铍病、囊性纤维化、检查点抑制剂诱发的肺炎、放射引发的肺炎、移植物抗宿主病、闭塞性细支气管炎综合征、慢性肺同种异体移植功能障碍、igg4相关肺部疾病、淋巴管平滑肌增生症、肺部淀粉样变性，得自肺癌、乳腺癌、结肠癌或肾细胞癌的肺转移，copd、肺气肿、和严重病毒和细菌肺炎患者中的ards。

38、在另一优选的本技术方法中，该预防和/或治疗与另一疗法组合，例如选自干扰素α2a或2b(不包括任何聚乙二醇化变体)、丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、和/或ii型跨膜蛋白酶(tmprss2)抑制剂(特别是卡莫司他)、可吸入皮质类固醇、血管活性肠肽(vip)和弗林蛋白酶抑制剂中的至少一种。

39、在该方法中，该用途的化合物可以如上所述作为合适的药物组合物进行提供和/或施用。化合物可以单独施用，或与其他有效化合物(例如与已知用于治疗上述疾病的药物)组合施用，其中在后一种情况中，观察到有利的附加、放大或优选协同的效果。施用至哺乳动物特别是人的合适量和剂量如上所述。

40、在根据本技术方法的优选实施方式中，化合物以例如0.1-10mg/剂次，优选0.2-5mg每剂次(对于70kg受试者，等于每次吸入约3-约80μg每千克)的有效剂量施用至该受试者。

41、在根据本技术方法的优选实施方式中，方法还包括监控步骤，其包括在从得自该哺乳动物受试者的样本中进行选自血清化学(包括电解质)、肾功能检测(例如肌酐、crcl和bun)、肝功能检测(例如alt、ast、总胆红素、和碱性磷酸酶)、血液学(例如全血细胞计数和凝血酶原时间)、和尿液分析中的分析，并将该分析与早些时间从该哺乳动物得到的和/或对照样本的分析进行比较。

42、本技术将参照附图在以下实施例中进一步描述，然而，本技术并不限制于此。出于本技术的目的，本文引用的所有文献通过引用的方式全部并入。