一种丁酸梭菌外泌体的制备方法及应用与流程

本发明涉及外泌体类生物制剂，具体涉及一种丁酸梭菌外泌体的制备及其在改善i型糖尿病小鼠空腹血糖、脂代谢紊乱或肠道菌群紊乱方面的应用。

背景技术：

1、外泌体是由细胞分泌的、尺寸为40-160nm的细胞外囊泡，具有脂质双分子层结构，包含细胞的许多成分，包括dna、rna、脂质、代谢物、细胞质和细胞表面蛋白质。最近有研究表明，细菌释放的细胞外囊泡通过将遗传物质和蛋白质从细菌转移到宿主，在微生物群落中发挥着多种作用。细胞外囊泡还可以直接与免疫细胞和上皮细胞相互作用，启动多种信号通路，并且可以被认为是介导宿主-病原体相互作用的肠道微生物群的功能单位。

2、外泌体mirna是人类疾病的重要调节因子；外泌体mirna与糖尿病相关并发症密切相关，如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病心肌病，作为一类新型调控分子，它们通过调节一系列相关基因的表达水平，参与糖尿病的多个步骤，主要表现在胰腺β细胞损伤和胰岛素抵抗方面,是诊断和治疗糖尿病的有前途的生物标志物和靶点。

3、近年来，益生菌在功能性乳制品、保健食品、微生态制剂及医疗等领域得到广泛应用，具体是指一类对宿主有功能性健康益处的活性微生物，具有调节人体免疫功能、改善肠道微生态平衡、降低血脂和促进营养物质消化与吸收等优点。常见的益生菌有乳酸菌、双歧杆菌、酪酸梭菌及酵母菌等。

4、肠道菌群益生菌的作用主要在于扶植正常肠道微生物菌群，调节生态平衡。丁酸梭菌(clostridium butyricum)作为机体肠道中最重要的生理性细菌，与人体的生长、新陈代谢密切相关，在人体健康和疾病等方面起着重要的作用。它属于严格的革兰氏阳性芽孢杆菌。菌体呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对存在，两端钝圆，芽孢偏心或次端生，呈圆形或椭圆形，发酵产酸，主要是丁酸、乙酸。现有研究表明，丁酸梭菌是具有特殊功能的益生菌，其微生态制剂具有促进其他益生菌繁殖等功效，且无毒、无残留。

5、国内外已有一些外泌体在糖尿病中作用机制的研究，但未报道丁酸梭菌外泌体对i型糖尿病小鼠肠道菌群结构的影响和改善空腹血糖和脂代谢的治疗作用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术存在的问题，发明人经过大量实验筛选和分离提取，得到一种丁酸梭菌(clostridium butyricum)外泌体，经动物实验证实，具有降低i型糖尿病小鼠空腹血糖水平和改善小鼠肠道菌群结构的作用，可用于i型糖尿病的预防或治疗产品的制备。

2、所述丁酸梭菌选自丁酸梭菌clostridiumbutyricum strain vpi3266或者丁酸梭菌clostridiumbutyricum strain jcm 1391、clostridiumbutyricum strainatcc 19398、clostridium diolis strain sh1、clostridium beijerinckii strain jcm 1390中的任意一种。

3、所述产品中丁酸梭菌外泌体蛋白浓度大于0.1mg/ml。

4、更优选的，所述丁酸梭菌clostridium butyricum strain vpi3266cgmccno.24206。

5、所述的产品可以是食品，保健品或药品。

6、本发明还提供一种所述的丁酸梭菌外泌体的分离制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

7、(1)液体富集培养丁酸梭菌至对数生长期，取150ml菌液；

8、(2)取菌液至冷冻离心机4℃，10000×g离心1h，取上清，重复两次；

9、(3)将上清液过0.22μm pvdf滤膜，得过滤上清；

10、(4)取100ml过滤上清通过300kda中空纤维柱，用300～500mlpbs溶液洗滤33～58min，得到20ml丁酸梭菌外泌体pbs溶液；

11、(5)对获得的外泌体pbs溶液过0.22μmpvdf针头过滤器；

12、(6)将步骤(5)获得的溶液用100kda超滤离心管4000×g，4℃离心10min，

13、得浓缩丁酸梭菌外泌体pbs溶液。

14、本发明提取方法简单，易操作，所述的丁酸梭菌外泌体，经粒径分析仪检测粒径、tem鉴定外泌体形态，符合外泌体特征。

15、本发明具有以下效果：

16、本发明分离提取的丁酸梭菌外泌体，可用于治疗由i型糖尿病引起的小鼠空腹血糖升高，改善糖尿病小鼠脂代谢紊乱现象。

技术特征：

1.一种丁酸梭菌外泌体在制备预防或治疗i型糖尿病产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，所述的丁酸梭菌外泌体制备所需菌种选自丁酸梭菌clostridium butyricum strain vpi3266或者clostridiumbutyricum strain jcm 1391、clostridiumbutyricum strainatcc 19398、clostridium diolis strain sh1、clostridiumbeijerinckiistrain jcm 1390中的任意一种。

3.如权利要求1所述的应用，所述的产品可以是食品，保健品或药品。

4.如权利要求1所述的应用，所述产品中丁酸梭菌外泌体含量大于0.1mg/ml。

5.一种丁酸梭菌外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述丁酸梭菌的接种量为2-5％；

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述培养至对数期的时间为6-28h。

技术总结本发明涉及医药领域，具体涉及丁酸梭菌外泌体制剂的制备及其在改善I型糖尿病小鼠空腹血糖、脂代谢紊乱或肠道菌群紊乱方面的应用。本发明提供了简单高效的丁酸梭菌外泌体制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)丁酸梭菌菌液的制备；2)丁酸梭菌菌液上清的制备；3)丁酸梭菌外泌体粗提物制备；4)丁酸梭菌外泌体浓缩液制备，本发明得到的丁酸梭菌外泌体具有脂质双分子层结构，粒径分分布均一，有改善I型糖尿病小鼠空腹血糖升高、脂代谢紊乱和肠道菌群紊乱方面的功效。技术研发人员：夏瑜泽,胡海峰,唐小渊,吴鹏,秦俪玲,高如远受保护的技术使用者：国药集团健康产业研究院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/13