一种猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶及其制备方法

本发明涉及生物医用材料、组织工程和再生医学的，尤其是指一种猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶及其制备方法。

背景技术：

1、目前临床上治疗睾酮缺乏症的的生物医用材料仍仅限于外源性睾酮补充，包括透皮凝胶、透皮贴片，这些生物医用材料能够通过皮肤渗透进入血液或透过阴囊作用于睾丸发挥作用，从而迅速提升机体睾酮水平，还能进一步提升男性生殖能力，对于轻微的睾酮缺乏症具有一定的治疗效果。然而，当需要长期给药才能维持机体睾酮水平的个体，外源性的睾酮补充不仅无法满足长期睾酮正常化的需要，而且还会产生严重的副作用，破坏下丘脑-垂体-睾丸的内分泌调控，导致内源性睾酮产生能力逐渐减退，透皮的生物医用材料还存在传递效率低、皮肤感染、接触传递给他人等不良影响。

2、脱细胞外基质水凝胶是来自于动物组织的天然生物材料，经过一系列脱细胞化处理，得到的材料具有生物安全性高、免疫原性低等优势，睾丸脱细胞外基质水凝胶具有睾丸微环境特异性的生物线索，能够对于睾丸微环境的改善具有良好的调控作用，同时，脱细胞外基质水凝胶有利于细胞的黏附和增殖，对于干细胞分化也有积极的促进作用。本发明根据胶原可以温敏自组装的特点，设计了对于睾丸组织独特的脱细胞处理和消化过程，得到了睾丸脱细胞外基质水凝胶，可以直接通过原位注射植入睾丸内，通过温度的改变固化成型，招募睾丸中的睾丸间质干细胞进行黏附并增殖分化为睾丸间质细胞分泌睾酮。特别地，睾丸脱细胞外机制水凝胶还存在大量调控睾丸微环境的酶和细胞因子，能够有效减少睾丸内部炎症，对逆转睾丸衰老具有不可忽视的作用。综上所述，脱细胞外基质在治疗睾酮缺乏症、延缓睾丸衰老领域有着巨大的应用潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶及其制备方法，该方法制备的水凝胶能够在体外呈现溶液形态，在注射至睾丸内之后的一段时间转变为凝胶状态，同时能够根据睾丸间质的结构自发形成适当的形状，不会对植入的睾丸产生损害，制备的水凝胶将dna等细胞成分降至最低，同时最大程度的保留了胶原、层粘连蛋白、糖胺聚糖等成分，这些成分对于调控细胞的增殖和干细胞的分化具有重要作用。

2、为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

3、1)将获取的猪睾丸组织经过多次冻融循环后，去除白膜和睾丸网组织，然后切碎成小块组织，再将小块组织依次置于洗涤液a、洗涤液b、消毒液c和去离子水搅拌清洗灭菌，得到洁白组织，将得到的洁白组织冷冻干燥研磨灭菌，得到脱细胞外基质粉末；其中，所述洗涤液a由0.05％-0.5％的tritonx-100和0.1％-1％的青霉素-链霉素混合溶液组成，所述洗涤液b由1x的pbs溶液和0.1％-1％的青霉素-链霉素混合溶液组成，所述消毒液c由4％乙醇和0.1％复合过氧乙酸消毒液混合溶液组成；

4、2)将得到的脱细胞外基质粉末置于消化液d中搅拌消化，消化完成后，再进行ph、离子浓度调节，得到猪睾丸脱细胞外基质预凝胶溶液，将猪睾丸脱细胞外基质预凝胶溶液置于温浴环境中一段时间，即可得到猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶；其中，所述消化液d采用0.01m-0.1m盐酸溶解胃蛋白酶。

5、优选的，在步骤1)中，所述洗涤液a和洗涤液b在搅拌期间每2-4h更换一次，所述消毒液c搅拌消毒1h。

6、优选的，在步骤1)中，所述小块组织的体积为1cm3-4cm3，搅拌过程每100g组织加入到1l搅拌溶液中，研磨的粉末颗粒尺寸为10-100μm。

7、优选的，在步骤1)中，所述冷冻干燥为-80℃冷冻干燥2-5天，灭菌为5-10kgy伽马射线辐射。

8、优选的，在步骤2)中，所述消化的过程是在无菌室温环境下，搅拌2-5天，搅拌速率600-800rpm消化脱细胞外基质粉末。

9、优选的，在步骤2)中，所述消化液d中胃蛋白酶浓度为1mg/ml-4mg/ml，加入脱细胞外基质粉末后得到的脱细胞外基质溶液浓度接近1％。

10、优选的，在步骤2)中，所述ph的调节采用1m-5m氢氧化钠溶液滴定脱细胞外基质溶液为ph＝6.8-7.5。

11、优选的，在步骤2)中，所述离子浓度的调节采用10xpbs溶液稀释至1xpbs溶液。

12、优选的，在步骤2)中，所述猪睾丸脱细胞外基质预凝胶溶液稀释至0.5％-1％，在34-38℃温浴20-50min。

13、本发明也提供了一种由上述方法制备得到的猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶，该水凝胶来自天然组织，具备低免疫原性和高生物相容性，并利用胶原自组装温敏成型，具有可注射性和可塑性，其主要成分胶原、层粘连蛋白能够有效地调控干细胞的黏附、增殖和分化，其来自于睾丸组织的特性具备超强的组织特异性，对于睾丸局部微环境的调控、睾酮激素的分泌具有良好的效果。

14、本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：

15、1、本发明构建了生物安全性高、免疫原性低的生物医用材料，通过一定温度温浴能够形成稳定的水凝胶。

16、2、脱细胞外基质水凝胶具有良好的可塑性和灵敏的温敏性，能够在植入后在睾丸间质形成稳定的凝胶。

17、3、为了最大程度的保留细胞外基质的生物组分的完整性，在脱细胞过程采用了温和的非离子洗涤剂，实现了胶原、层粘连蛋白和糖胺聚糖的高度保留。

18、4、保留的生物组分中含有大量的生物信号线索，能够在睾丸内募集细胞，从而作用于睾丸间质干细胞分化为睾丸间质细胞并分泌睾酮，水凝胶能够为促黄体激素提供更多特异性受体，从而提升睾酮合成的效率，进而男性个体的生殖能力。

19、5、制备的脱细胞外基质水凝胶中的有大量的细胞因子和酶，对睾丸微环境的炎症有一定的抑制作用。

20、6、脱细胞外机质材料制备价格低廉，粉末的形式也便于储存，还具备良好的可降解能力，可作为一种性能优良和多功能的生物医用材料，有良好临床应用前景。

技术特征：

1.一种猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述洗涤液a和洗涤液b在搅拌期间每2-4h更换一次，所述消毒液c搅拌消毒1h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述小块组织的体积为1cm3-4cm3，搅拌过程每100g组织加入到1l搅拌溶液中，研磨的粉末颗粒尺寸为10-100μm。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述冷冻干燥为-80℃冷冻干燥2-5天，灭菌为5-10kgy伽马射线辐射。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述消化的过程是在无菌室温环境下，搅拌2-5天，搅拌速率600-800rpm消化脱细胞外基质粉末。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述消化液d中胃蛋白酶浓度为1mg/ml-4mg/ml，加入脱细胞外基质粉末后得到的脱细胞外基质溶液浓度接近1％。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述ph的调节采用1m-5m氢氧化钠溶液滴定脱细胞外基质溶液为ph＝6.8-7.5。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述离子浓度的调节采用10xpbs溶液稀释至1xpbs溶液。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述猪睾丸脱细胞外基质预凝胶溶液稀释至0.5％-1％，在34-38℃温浴20-50min。

10.由权利要求1-9任一项所述方法制备得到的猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶，该水凝胶来自天然组织，具备低免疫原性和高生物相容性，并利用胶原自组装温敏成型，具有可注射性和可塑性，其主要成分胶原、层粘连蛋白能够有效地调控干细胞的黏附、增殖和分化，其来自于睾丸组织的特性具备超强的组织特异性，对于睾丸局部微环境的调控、睾酮激素的分泌具有良好的效果。

技术总结本发明公开了一种猪睾丸脱细胞外基质温敏水凝胶及其制备方法，包括：使用冻融循环破坏细胞膜，使用温和洗涤剂TritonX‑100进行脱细胞处理，在有效的去除睾丸细胞的同时，高度保留了睾丸的生物组成和结构支架。该水凝胶能够在注射睾丸后迅速固化成型，适应睾丸复杂环境，同时募集睾丸间质干细胞，调控其分化为睾丸间质细胞，进而分泌睾酮。此外，水凝胶还能够在体内酶的作用下降解，释放细胞因子，降低睾丸间质炎症反应。水凝胶还具有高度的生物安全性和低免疫原性。技术研发人员：施雪涛,杨超受保护的技术使用者：华南理工大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13