一种提高鱼苗成活率的基于卵黄抗体的生物制剂的制作方法

本发明涉及水产养殖，具体是涉及一种提高鱼苗成活率的基于卵黄抗体的生物制剂。

背景技术：

1、鱼苗成活率是指在孵化或引种过程虫鱼苗的存活比例。提高鱼苗成活率对于渔业养殖和河流生态恢复都非常重要。以下是一些提高鱼苗成活率的方法：

2、1.优化水质：鱼苗对水质的要求较高，因此保持水质清洁和稳定是提高鱼苗成活率的关键。监测和维持适宜的水温、溶解氧和ph值，避免有害物质如氨氮和硫化氢的积累。使用过滤设备和定期更换水质，确保水质的良好质量；

3、2.提供适宜的饵料：为鱼苗提供适宜的饵料是提高其成活率的重要因素之一，根据各种鱼类的饲养要求，为其提供适宜的饵料，包括鱼类鲜活、人工饲料、小型无脊椎动物等，确保饵料的新鲜和多样性，以满足不同生长阶段鱼类的营养需求；

4、3.提供适宜的栖息环境：鱼类对于栖息环境的要求较高，提供适宜的栖息环境可以帮助鱼类降低压力和疾病的风险，从而提高其成活率，根据鱼类的特点，提供适宜的水深、水流、湿度、植被和底栖物。

5、此外还有很多可以提高鱼苗成活率的手段，使用多种方法能够进一步提高鱼苗的成活率，其中，对于饵料的研究是目前的热点话题，关于卵黄抗体提高鱼苗成活率已有不少人对此进行了研究，卵黄抗体是存在于两栖动物，爬行动物和鸟类的主要血清抗体，主要保护发育中的胚胎免受潜在病原体的侵害，为新生的雏禽提供有效的被动免疫保护。

6、专利cn109438575b公开了一种大口黑鲈弹状病毒卵黄抗体，包括通过以下方法制备而得：(1)从感染大口黑鲈弹状病毒的大口黑鲈中分离培养获得大口黑鲈弹状病毒；(2)对大口黑鲈弹状病毒进行灭活；(3)以灭活的大口黑鲈弹状病毒为抗原对180～190日龄的产蛋鸡进行免疫，收集免疫后产蛋鸡的鸡蛋，从鸡蛋的卵黄中提取纯化卵黄抗体。该专利有效中和大口黑鲈弹状病毒，从而终止病毒感染，但有一定的局限性。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明提供了一种提高鱼苗成活率的基于卵黄抗体的生物制剂。

2、本发明的技术方案是：

3、一种提高鱼苗成活率的基于卵黄抗体的生物制剂，按质量百分百计，包括：面粉10～15％、植物油2～5％、蚯蚓粉2～3％、改性卵黄抗体0.2～2％，余量为杂粮粉；

4、所述改性卵黄抗体的制备方法为：

5、s1、蛋鸡免疫：将灭活的柱状嗜纤维菌对蛋鸡进行注射免疫，共注射四次，每次注射1～1.6ml，每次注射结束一周后，给蛋鸡只喂食芽孢杆菌饲料，一日两次，喂食一周后再次进行注射；

6、s2、改性卵黄抗体提取：完成蛋鸡免疫的四次注射免疫后的两周后，每天收取鸡蛋并持续三天，将收集到的鸡蛋进行卵黄分离得到卵黄液，将卵黄液与去离子水按照1:8的重量比例混合，加入盐酸调节ph至4.5～5，在-18～20℃下保存12h，随后在4～5℃下解冻，将上清液过滤得到改性卵黄抗体水溶液，将改性卵黄抗体水溶液通过两次盐析后，再经过超滤浓缩得到改性卵黄抗体浓缩液，将改性卵黄抗体浓缩液冷冻干燥得到冻干改性卵黄抗体粉末。

7、进一步地，所述杂粮粉为米糠和小麦麸皮以1:1的重量比例混合而成。

8、说明：通过将杂粮粉作为该生物制剂的主要营养成分，能够确保其中卵黄抗体的吸收。

9、进一步地，所述步骤s1中灭活的柱状嗜纤维菌制备方法为：

10、将感染柱状嗜纤维菌的草鱼整个搅碎摇匀，在1000～2000rpm转速下离心15min后取上清液并通过细菌过滤器过滤得到柱状嗜纤维菌粗提液，取未感染柱状嗜纤维菌的草鱼肾细胞系cik细胞在2216e培养基中进行培养，当cik细胞的汇合度达到60～80％时，加入柱状嗜纤维菌粗提液，待cik细胞病变率＞60％后，在1000～2000rpm转速下离心15min取上清液，置于-80℃下保存24h，冻融两次后在24～28℃下加入质量浓度为0.5％的甲醇溶液后震荡灭活24h，再使用pbs溶液在100～200rpm转速下离心15min洗涤3次，得到浓度为109cfu/ml的灭活的柱状嗜纤维菌。

11、说明：通过合理的灭活方法能够保证蛋鸡的疫苗接种成功。

12、进一步地，所述步骤s1中前两次注射时，颈部皮下注射0.4ml，左右胸肌各注射0.3ml，第三次注射时，颈部皮下注射0.4ml，左右胸肌各注射0.4ml，第四次注射时，颈部皮下注射0.6ml，左右胸肌各注射0.5ml。

13、说明：通过优选合理的疫苗注射方式能够保证蛋鸡接种疫苗成功的同时保证蛋鸡的成活率。

14、进一步地，所述步骤s1中芽孢杆菌饲料按重量份计，包括浓度为5～6×106cfu/g的芽孢乳杆菌粉末4～8份，玉米15～25份，豆粕10～15份，大蒜1～2份，浓度为1～2×106cfu/g的乳酸杆菌粉末2～3份，芽孢杆菌饲料的含水率为10～15％。

15、说明：通过在进行蛋鸡疫苗接种的过程中调节进食饲料的配方从而进一步提高蛋鸡在进行疫苗接种过程中的成活率。

16、进一步地，所述步骤s2中改性卵黄抗体水溶液两次盐析的方法为：

17、第一次盐析：向改性卵黄抗体水溶液中加入质量浓度为40％的硫酸铵溶液，使改性卵黄抗体水溶液与硫酸铵溶液的体积比为5:3，搅拌均匀后在4℃下保存12h，在10000～12000rpm转速下离心15min后取沉淀，使用去离子水定容至原改性卵黄抗体水溶液的体积；

18、第二次盐析：继续向改性卵黄抗体水溶液中加入质量浓度为40％的硫酸钠溶液，使第一次盐析后的改性卵黄抗体水溶液与硫酸钠溶液的体积比为5:1，搅拌均匀后在4℃下保存12h，在10000～12000rpm转速下离心15min后取沉淀，使用去离子水定容至原改性卵黄抗体水溶液的体积后，得到改性卵黄抗体提取液。

19、说明：通过优化调整盐析的方法保证了卵黄抗体的性质不受破坏。

20、更进一步地，所述步骤s2中超滤浓缩的方法为：

21、将改性卵黄抗体提取液采用超滤膜包进行超滤浓缩，直至溶液体积为原改性卵黄抗体提取液体积的1/8～1/6，使用摩尔浓度为1～2mol/l的naoh溶液清洗超滤膜包至原改性卵黄抗体提取液体积，得到清洗液，再使用去离子水将清洗液中的naoh溶液洗涤置换，加入原改性卵黄抗体提取液体积20～30％的质量浓度75％的酒精溶液，在4℃下下保存12h得到改性卵黄抗体浓缩液。

22、优选地，所述步骤s2中冷冻干燥的方法为：

23、将改性卵黄抗体浓缩液在-20℃下冷冻保存24h，随后在-70℃下冷冻保存2h，使用冷冻干燥机在真空度为15～20pa下冷冻干燥36h得到冻干改性卵黄抗体粉末。

24、上述一种提高鱼苗成活率的基于卵黄抗体的生物制剂的应用，将所述生物制剂应用于草鱼养殖中，具体方法为：

25、在4～10月份的鱼苗喂养中，生物制剂与普通鱼饲料的重量比例为1:3，且生物制剂中改性卵黄抗体的含量为2wt％；

26、在11～次年3月份的鱼苗喂养中，生物制剂与普通鱼饲料的重量比例为1:5，且生物制剂中改性卵黄抗体的含量为0.2wt％。

27、说明：通过优化调节本发明的生物制剂在草鱼养殖过程中的具体添加计量，在不同月份使用不同的添加量，从而针对养殖环境的不同将本发明的生物制剂效果发挥到最大化。

28、本发明的有益效果是：

29、(1)本发明的一种提高鱼苗成活率的基于卵黄抗体的生物制剂通过含柱状嗜纤维菌的改性卵黄抗体制备得到的生物制剂，能够有效提高草鱼鱼苗的成活率，在制备改性卵黄抗体时采用了一系列改进方法从而提高接受免疫蛋鸡的成活率，得到的改性卵黄抗体具有良好的免疫效果，并且配合本发明的应用方法能够显著降低草鱼鱼苗感染柱状嗜纤维菌的比例，提高鱼苗整体免疫力，在8天内草鱼鱼苗的累计存活率为82％左右。

30、(2)本发明的一种提高鱼苗成活率的基于卵黄抗体的生物制剂在制备改性卵黄抗体时同步研发出了相关的蛋鸡饲料配方，从而降低蛋鸡在接种灭活的柱状嗜纤维菌后发生死亡的概率，使生物制剂的制备更加高效，节省成本。

31、(3)本发明的一种提高鱼苗成活率的基于卵黄抗体的生物制剂的应用通过优化调节本发明的生物制剂在草鱼养殖过程中的具体添加计量，在不同月份使用不同的添加量，从而针对养殖环境的不同将本发明的生物制剂效果发挥到最大化。