基于线激光细胞操控的光片照明荧光显微成像系统

本发明提供的是一种基于线激光细胞操控的光片照明荧光显微成像系统。通过柱面透镜整形得到线激光光镊和照明光片，线激光稳定捕获细胞，并精准操控细胞旋转，照明光片激发细胞中的荧光物质，从而获取高时间和空间分辨率的细胞三维结构层析图像，属于光操控和光学显微成像领域。

背景技术：

1、光片照明荧光显微成像技术是活体样品三维成像的理想技术之一，其不同于传统显微技术的照明方式将对样品的光损伤降低20-100倍。应用广泛的宽场荧光显微镜在物镜焦平面的照明光最强，但焦平面上下的样品同样会被照亮。这种照明方式会使焦平面以外的荧光信号进入图像以及对样品引入额外的光损伤。激光扫描共聚焦荧光显微镜虽然能过滤焦平面的以外的荧光信号，实现三维成像，但仍会引入额外的光损伤。而且，由于其点扫描的成像方式所使用的成像元件效率很低，为达到较快的成像速度，则需要更强的激发功率，这就导致了相较于宽场荧光显微镜更严重的光毒性和光漂白。光片照明荧光显微成像技术的照明光是与成像平面平行的光片。这种照明方式使其具备层析能力，且避免了离焦荧光信号的干扰，有效提高了轴向分辨率，极大程度地降低了光损伤。

2、然而，使用光片照明荧光显微成像技术对活体生物样品成像时，要么移动或旋转样品使光片完整地将样品扫描，要么保持样品静止，控制光片扫描整个样品。前者需制作特殊装置将待测样品固定在照明物镜和探测物镜之间，保证待测样品能够被精确定位和扫描，以及自由旋转。在这过程中就无法避免对样品活性的损害，以及液态环境的扰动对成像质量的影响。后者需要控制光片快速扫描及探测物镜焦平面跟随光片的精准调控，大大增加了系统的复杂程度和成本。如何克服这些技术难题获得层析图像，是我们将探究的问题。

3、激光光镊的提出及其操控微珠的成功实现，为解决上述lsfm所面临的技术难题提供了新思路。近年来，报道了许多不同形状的激光光镊，比如点激光光镊，单线形激光光镊，双线形激光光镊等。线形激光光镊的成功提出并被用于观察细胞-脂质体相互作用、微观物体的旋转和短程胶体相互作用。激光光镊使我们实现了对微粒的主动操控，以非接触的方式操控微粒运动，极大程度的保证了操控的自由度。

4、本发明提供一种基于线激光细胞操控的光片照明荧光显微成像系统。该发明利用线激光光镊操细胞光轴旋转，光片保持静止，操控细胞旋转的同时采集样品的荧光层析图像。我们的研究将光片照明荧光显微技术与线激光光镊的光操控技术相结合，实现了在不影响细胞自身性质及其所处环境的前提下，以非接触、无损伤的方式捕获处于液态环境中的实验体，使其绕特定转动轴进行稳定而精准的主动光操控，并且成功采集细胞不同角度的荧光层析图像。该方法使实时获取具有高的时间分辨率和空间分辨率的活体单细胞内部三维结构层析图像并对其生命活动过程进行长时间动态监测的实现成为可能，且利用这种成像方法设计的成像系统采集荧光图像的优势在于对实验样品的精准控制，且经济适用性高。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于线激光细胞操控的光片照明荧光显微成像系统。该系统可以以非接触极低损伤的方式稳定捕获和精准操控细胞，并且可快速地获取细胞的三维结构层析图像，极大地缓解了传统荧光显微技术对活体细胞的光漂白性与光毒性问题。该系统较其他荧光显微系统，具有灵活性高、易于操作、成本低等特点。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、其特征是：它由激光光源1、6，柱面透镜2、7，平凸透镜3、5、8、9，反射镜4、11，双色镜10，物镜12、14，样品13，滤光片15，管透镜16，ccd相机17组成。

4、线激光细胞操控主要由中心波长1064nm的连续激光光源1和柱面透镜2实现。激光光源1的激光光束由柱面透镜2整形后形成线激光光镊，经平凸透镜3、5扩束平行，再经物镜12聚焦在样品13处，操控光将样品处的细胞捕获后，可通过旋转柱面透镜控制细胞绕光轴旋转。

5、光片照明部分主要由中心波长532nm的连续激光光源6和柱面透镜7实现。激光光源6的激光光束由柱面透镜7整形后得到照明光片，经平凸透镜8、9扩束平行，再经物镜12聚焦在样品13处，照明光片将激发捕获光捕获的细胞内部的荧光物质，并产生荧光信号。在此，捕获光和照明光是经过双色镜10合束后使用同一物镜输出，目的有：(1)节约实验资源；(2)可最大程度确保光片与线激光光镊同轴输出，使光片聚焦位置与线激光光镊一致。

6、荧光收集部分，即探测端，由物镜14、滤光片15、管透镜16和ccd相机17实现。探测轴需垂直于照明光片，即物镜14的焦平面与照明光片所在平面重合。探测过程中，照明光片保持静止，捕获光操控细胞绕光轴旋转，则可以使照明光片在细胞旋转的过程中激发细胞中不同位置的荧光物质并产生荧光信号，荧光信号被探测端的物镜14收集，经滤光片15过滤杂散光，管透镜16聚焦后由ccd相机17成像。

技术特征：

1.本发明提供的是一种基于线激光细胞操控的光片照明荧光显微成像系统，其特征是：它由激光光源1、6，柱面透镜2、7，平凸透镜3、5、8、9，反射镜4、11，双色镜10，物镜12、14，样品13，滤光片15，管透镜16，ccd相机17组成；激光光源1发射的激光光束作为操控光，激光光源6发射的激光光束作为照明光，两束光分别由柱面透镜2、7整形，再经过平凸透镜3、5和8、9扩束平行，最后由双色镜10将两束激光合束，被物镜12聚焦在样品13处，物镜14收集样品13中被激发的荧光信号，荧光信号经滤光片15和管透镜16聚焦后由ccd相机17成像。

2.根据权利要求1所述的操控光部分，其特征是：激光光源1的激光光束由柱面透镜2整形后形成线激光光镊，经平凸透镜3、5扩束平行，再经物镜12聚焦在样品13处，操控光将样品处的细胞捕获后，可通过旋转柱面透镜控制细胞绕光轴旋转。

3.根据权利要求1所述的照明光部分，其特征是：激光光源6的激光光束由柱面透镜7整形后得到照明光片，经平凸透镜8、9扩束平行，再经物镜12聚焦在样品13处，由于捕获光和照明光是经过双色镜10合束后的同轴输出，所以照明光片将激发捕获光捕获的细胞内部的荧光物质，并产生荧光信号。

4.根据权利要求1所述的荧光收集部分，其特征是：荧光收集部分为探测端，探测轴需垂直于照明光片，探测过程中，照明光片保持静止，捕获光操控细胞绕光轴旋转，则可以使照明光片在细胞旋转的过程中激发细胞中不同位置的荧光物质并产生荧光信号，荧光信号被探测端的物镜14收集，经滤光片15过滤杂散光，管透镜16聚焦后由ccd相机17成像。

技术总结本发明提供的是一种基于线激光细胞操控的光片照明荧光显微成像系统。其特征是：该系统利用柱透镜产生照明光片和线激光光镊，线激光光镊捕获并精确控制细胞的旋转，照明光片在细胞旋转过程中激发细胞中不同位置的荧光物质实现光片对细胞的层析。最重要的是，与传统荧光显微成像方法相比，该方案是对实验对象直接进行操控、观测，降低了实验对象在样品容器里的位置改变所造成的图像采集和重构的不确定性和误差。本发明构建的系统可对大尺寸活体单细胞或多细胞进行高时空分辨率三维层析成像，具有光损伤小、空间分辨率高、操作灵活、成本低等特点，在医学和生命科学等研究领域具有广泛的应用前景。技术研发人员：尹君,梁锐婧,于凌尧,苗琰,郑佳雯,韦耀鹏,苑立波受保护的技术使用者：桂林电子科技大学技术研发日：技术公布日：2024/5/27