油楠转录因子SgWRKY13基因及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，更具体的说是涉及油楠转录因子sgwrky13基因及其应用。

背景技术：

1、油楠(sindora glabra)是豆科油楠属乔木，其茎部富含有大量的萜类树脂油，主要成分为苦巴烯和石竹烯。古巴烯具有重要的生态价值，其可强烈吸引农业害虫地中海实蝇。同时，古巴烯也是很多高档精油的主要成分，具有杀菌、消炎、抗氧化、镇痛等多种功能。石竹烯可以作为食品香料使用。因此，油楠树脂油在药用、食品和精油等方面表现出较大的应用潜力。

2、sgtps是从油楠基因组中鉴定得到催化古巴烯合成的关键萜类合成酶基因，可催化底物法基焦磷酸(fpp)产生特异的α-古巴烯和β-古巴烯化合物，可用于古巴烯的大量生产和合成。

3、然而，目前在利用代谢工程手段生产目标代谢产物时多局限于单一功能基因，对于启动结构基因表达的转录因子的应用较少涉及，而转录因子可以直接与目标基因启动子结合，精准调控目标基因表达，而且转录因子可以同时激活代谢通路中多个结构基因的表达，从而导致目标产物的大量合成。

4、因此，挖掘能够精准启动目标基因表达的转录因子是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种调控萜类合成酶基因sgtps表达的转录因子，该转录因子可与sgtps启动子直接结合，激活sgtps的表达，为利用代谢工程手段生产古巴烯等萜类化合物提供有效的目标基因资源。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、油楠转录因子sgwrky13基因，其编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:2所示。

4、作为优选的技术方案，所述油楠转录因子sgwrky13基因的核苷酸序列如seq idno:1所示。

5、atgtcaactacatctgaggctattgcgaaccacagcttgtttgaggagaatcagggtgatcagatgcatacgcagatgggtttccttccttttccagcaaatctgaaccttccctttgcttgtaaccaatctctgaaagccttcagcaccatgcctcctccttctcttgcatcagaagcaggttcagctactgcaaacctagccgaaaccctactcatttccgccgctcaaaagcaaagagaagacctcacttcttgtttgggagcagcccaactcctttccttgcaaagatcgagtgcaaatccatgggcatggggagaagtatgcgatttgagcggaaagggaaatgggggagaagagcatcatcatctgagtgtctctgcaatgaagatgaagaagatgaaggcaagaaggaaggtgagggagccaaggttttgcttcaaaaccatgagcgacgtggatgtgttagatgatggctacaagtggagaaagtacggccagaaagtggtcaagaacacccagcaccccagaagctactaccggtgcacacaagataactgccgcgtaaagaaacgagtggagcgcttagcggaagatccaaggatggtaataaccacatacgaagggagacatgtccattctccctcaaatgatcttgaagattctcaatctccttcccatcaccttaacaatttcttctggtaa，seq id no.1。

6、msttseaianhslfeenqgdqmhtqmgflpfpanlnlpfacnqslkafstmpppslaseagsatanlaetllisaaqkqredltsclgaaqllslqrssanpwawgevcdlsgkgnggeehhhlsvsamkmkkmkarrkvreprfcfktmsdvdvlddgykwrkygqkvvkntqhprsyyrctqdncrvkkrverlaedprmvittyegrhvhspsndledsqspshhlnnffw，seq id no.2。

7、本发明所述sgwrky13基因为转录因子，该转录因子可与sgtps启动子直接结合，激活sgtps的表达，进一步合成包括桉叶醇、大牛儿烯d、石竹烯、和/或蒎烷在内的萜类化合物。

8、本发明采用如下方法克隆得到sgwrky13基因：

9、(1)从油楠韧皮部组织为材料提取总rna。在本发明中，油楠总rna的提取采用本领域常用的提取细胞总rna的技术方案即可，本发明的实施例中具体的可采用rna试剂盒提取(tiangen,dp441)法。

10、(2)在提取得到油楠总rna后，将所述总rna反转录合成cdna。在本发明中，所述的cdna的合成采用本领域常规的cdna的合成方法即可，无其他特殊要求；具体的本发明实施例中采用vazyme公司hiscript 1st strand cdna synthesis kit试剂盒完成。

11、(3)在得到cdna之后，进行sgwrky13基因pcr扩增，得到目的片段。在本发明中，所述的sgwrky13基因pcr扩增采用本领域常规的pcr扩增方法即可。具体的，本发明实施例中，所述sg wrky13基因pcr扩增采用vazyme公司phanta max super-fidelity dnapolymerase完成。反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，1min；72℃，1min 30s；35个循环；72℃延伸5min。引物序列如下：正向引物：5'-gcgggtcgacggtaccatgtcaactacatctgaggc-3'，seq id no.3；反向引物：5'-tagacatatgggtaccttaccagaagaaattgttaaggtg-3'，seq id no.4。

12、(4)在pcr扩增得到目的片段后，通过电泳判读结果，得到sgwrky13基因。

13、(5)将扩增所得目的片段连接到pcambia2301-ky，导入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，经菌落pcr验证为阳性克隆后，进行测序。在本发明中，载体线性化采用本领域常规的kpni酶即可；重组反应采用常规的方法即可。具体的，本发明实施例中，采用thermo公司或takara公司的kpni酶产品进行酶切；采用vazyme公司clonexpress-iione step cloningkit试剂盒进行重组。

14、本发明的又一目的是，提供油楠转录因子sgwrky13蛋白，其氨基酸序列如seq idno:2所示。

15、本发明的又一目的是，提供含有上述油楠转录因子sgwrky13基因的生物材料，所述材料为表达盒、表达载体、克隆载体和/或工程菌。

16、本发明的又一目的是，提供上述基因或上述生物材料的应用，所述应用为以下任意一种：

17、a.在调控植物萜类化合物合成中的应用；

18、b.植物育种；

19、c.制备转基因植物。

20、作为优选的技术方案，所述萜类化合物包括桉叶醇、大牛儿烯d、石竹烯、和/或蒎烷。

21、作为优选的技术方案，所述植物包括但不限于拟南芥、油楠。

22、本发明的又一目的是，提供一种培育高产萜类化合物植物的方法，将sgwrky13基因构建到植物表达载体pcambia2301-ky上，采用花粉管通道法将油楠转录因子sgwrky13基因转入到拟南芥植株中，获得sgwrky13基因过表达的转基因植株。

23、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种调控油楠关键萜类合成酶sgtps基因表达的转录因子sgwrky13基因及其应用。本发明通过对sgwrky13基因功能的解读，对于在植物体内准确大量的表达植物次生代谢物(萜类化合物)提供一种有效的基因资源，对于重要次生代谢物的高效生产具有重要的意义。