单个B淋巴细胞克隆兔IgG重链全长基因的方法与流程

本发明涉及基因工程、抗体工程、细胞工程等，尤其涉及单个b淋巴细胞高效克隆抗体igg重链全长基因的方法。

背景技术：

1、1975年以细胞融合为基础的兔杂交瘤技术问世，开创了制备单克隆抗体的新时代，兔源单克隆抗体高度的特异性和均一性使其在检测、临床治疗中均显示了巨大的应用价值。

2、目前制备兔单克隆抗体的技术方案有3种，一是杂交瘤技术，即利用兔骨髓瘤细胞与b淋巴细胞进行融合来制备单克隆抗体。但与鼠杂交瘤技术不同的是，可能是由于兔强大的免疫系统，无法像小鼠一样被化学诱导产生骨髄瘤，从而难以建立用于制备杂交瘤单克隆抗体的融合细胞株。芝加哥loyola大学的katherine knight教授在上个世纪九十年代中期制备了世界上第一株兔源的杂交瘤，可以与b淋巴细胞融合分泌兔单克隆抗体，但第一代杂交瘤细胞株(240e-1)融合后分泌兔单克隆抗体产量低且不稳定。robert pytela和朱伟民等在以240e-1为原始细胞株，并对其进行不断的筛选，目前开发出能够稳定产生抗体蛋白质的细胞株240e-w2与240e-w3。并申请了专利进行全面的保护。由于兔杂交瘤技术的专利限制，导致此技术其他公司难以应用；

3、二是通过噬菌体表达文库进行筛选，即将编码抗体的基因cdna片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。导入了各种各样抗体基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。当用一个抗原去筛查一个噬菌体展示库时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源肽相结合，进而分离出展示库里的某个特定的噬菌体，研究分析该噬菌体所含外源基因的序列和生物学功能，就能够获得有抗原结合活性的抗体轻链或重链的基因片段。作为一种抗体基因的发现技术，构建噬菌体文库需要首先对抗体基因进行反转录，即将抗体基因的mrna序列转变为cdna序列，由于mrna的不稳定性，目前常规反转录技术难以获得抗体基因的完整cdna序列，另外，由于噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。该方法获得的抗体igg重链基因通常是不完整的，导致其与抗原的亲和力降低，后期需要利用抗体亲和力成熟技术，即通过构建突变体库的方法进一步筛选高亲和力的抗体。因此该克隆技术无法获得完整抗体igg基因全长序列。

4、三是利用b淋巴细胞分离筛选结合基因克隆技术直接获得抗体轻重链可变区基因，在分别与已知的抗体fc区进行拼接，然后配对转染细胞后进行活性单克隆抗体的筛选。

5、目前利用b淋巴细胞法进行抗体基因克隆通常是分2步，首先是通过巢式pcr或单细胞测序分别克隆抗体的轻重链的可变区序列，然后将获得的可变区序列与固定的恒定区序列在体外进行拼接后进行表达和活性筛选。目前艾博抗(上海)贸易有限公司、亚诺法生技股份有限公司、南京德泰生物工程有限公司、优睿赛思(武汉)生物科技有限公司和苏州缔码生物科技有限公司等是采取此工艺技术生产重组兔单克隆抗体。

6、由于抗体分子结构包括可变区和恒定区2个部分，上述技术获得仅是抗体的可变区序列结构，后期需要进一步拼接上固定的抗体fc区序列，结合表达后的活性检测以获得单克隆抗体。上述工艺破坏了抗体在可变区和恒定区之间铰链区的天然结构，需要对抗体轻重链基因进行随机配对再验证抗体活性，降低了抗体与抗原的亲和力，制备的抗体不属于真正意义上的兔源全结构抗体。

7、现有技术中尚无法实现从兔单个b淋巴细胞中克隆igg抗体重链全长基因序列，从而体外重组具有全天然结构的兔igg单克隆单克隆抗体。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供利用单个b淋巴细胞进行高效克隆兔igg重链全长基因的方法。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种单个b淋巴细胞克隆兔igg重链全长基因的方法，所述方法包括：

4、(1)以兔外周全血(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)为样本，利用密度梯度离心法，分离出淋巴细胞层，制备单核细胞悬液；

5、(2)利用磁珠分选技术对步骤(1)所述的单核细胞悬液进行第一次分选，得到阳性b淋巴细胞悬液；利用微流控技术对所述的阳性b淋巴细胞悬液进行第二次分选，得到单细胞；

6、(3)用单细胞裂解液对步骤(2)所述的单细胞进行裂解，所得裂解液通过反转录合成cdna；

7、(4)以步骤(3)所述的cdna为模板，以正向引物和反向引物进行pcr扩增，得到所述单个b淋巴细胞克隆兔igg重链全长基因；

8、所述正向引物为下列之一：

9、

10、所述反向引物为下列之一：

11、

12、优选地，所述正向引物为下列之一：

13、2-f、4-f、5-f、8-f、9-f、11-f、12-f、13-f；

14、所述反向引物为下列之一：

15、2-a、4-a、5-a、8-a、9-a、11-a、12-a、13-a。

16、进一步优选地，

17、所述正向引物为下列之一：

18、12-f、13-f；

19、所述反向引物为下列之一：

20、12-a、13-a。

21、特别优选地，所述正向引物为13-f，所述反向引物为13-a。

22、本发明提供了简单、快速、高效的从单个b淋巴细胞中克隆兔igg抗体重链可全长基因序列的方法。本发明采用终点法直接克隆兔igg抗体重链可全长基因序列的方法，极大的简化了制备兔单克隆抗体的步骤。根据保守区设计的引物可以有效扩增出兔igg抗体重链cdna全长基因序列。

23、在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述兔外周全血是经过耳缘抽取的静脉血。进一步，所述兔外周全血用样本稀释液进行稀释后，利用兔淋巴分离液进行密度梯度分离，吸取第二层的淋巴细胞，用无钙镁的pbs缓冲液悬浮，得到所述单核细胞悬液。更进一步，所述兔外周全血与所述样本稀释液的体积比为1︰1；所述兔外周全血与所述兔淋巴分离液的体积比为1︰2；所述兔外周全血与所述无钙镁的pbs缓冲液的体积比为10︰3。本发明所用的兔外周全血取自4～9月龄的雌性或雄性新西兰兔。

24、在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，第一次分选为：将生物素化抗兔igg抗体与链霉素亲和磁珠偶联，得到标记磁珠；将所述标记磁珠与步骤(1)所述的单核细胞悬液于2-8℃下共孵育，通过磁力架分离上清后，以无钙镁的pbs缓冲液悬浮，得到阳性b淋巴细胞悬液。进一步，所述生物素化抗兔igg抗体与所述链霉素亲和磁珠的质量比为20μg︰1mg；所述链霉素亲和磁珠的质量以步骤(1)所述的单核细胞悬液的体积计为4μg/ml。

25、本发明避免了目前利用单一兔b淋巴细胞细胞表面的标志物进行分选具有的操作繁琐、效费比低的缺点，显著的提高了兔单个b淋巴细胞的分选效率。

26、在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，第二次分选为：用无钙镁的pbs缓冲液将b淋巴细胞悬液稀释，至细胞浓度为1×104个/ml-1×106个/ml，利用单细胞仪在单细胞模式下进行分选。使用单细胞仪在分选压力小于0.138bar的条件下分选到预装有单细胞裂解液的96孔板中，立即干冰冷冻后放到-80℃冰箱备用。

27、在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述反转录的引物为oligo dt引物。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明采用的技术方案，本发明仅需外周血液样品10ml,就可以在1天内获得多达上百个igg抗体的重链全长基因序列，与目前通过pcr方法或单细胞测序法仅克隆igg可变区，然后在体外与igg恒定区重组的方法相比，一方面极大的缩短了克隆抗体基因所需要的时间；另一方面由于保留了抗体的天然结构而具有高亲和力，省略了前者需要进行亲和力成熟等过程，为制备高亲和力的兔单克隆抗体发现项目提供了有力的技术支撑。