一种PBase蛋白、融合蛋白、核酸和基因整合系统及应用的制作方法

本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种pbase蛋白、融合蛋白、核酸和基因整合系统及应用。

背景技术：

1、内源基因突变引起的蛋白功能缺失引起很多人类疾病，当前基因治疗的一种主要策略是导入正确序列的外源基因(gene of interest,goi)并稳定表达，以弥补内源的蛋白功能缺失。实现外源基因稳定表达的一个主要策略是将外源基因序列通过病毒整合、转座酶-转座子体系或crispr-cas系统介导的同源重组(homology recombination,hr)等方法整合到基因中。病毒整合和转座酶-转座子体系能高效地将外源基因整合到基因组中，但其随机整合特性导致它们具有较高的遗传毒性。crispr-cas介导的dsb通过同源重组(hr)通路修复可以实现外源基因定点整合，但整合的基因片段长度较短且整合效率较低，此外制备包含同源臂的线性供体dna(donor dna)既耗时又昂贵。因此，开发能将外源dna序列(尤其是长片段)高效地整合到基因组特定位点的新基因编辑工具，成为当前基因治疗领域的一个主要挑战。

2、pb转座酶-转座子体系能高效在哺乳动物细胞中进行基因转座整合，为通过分子进化开发高效的定点整合新工具提供了良好的分子基础。pb转座酶(pbase)可以切割携带goi的转座子dna，并以无缝粘贴的方式高效整合到哺乳动物基因组中的“ttaa”靶位点。此前有研究表明通过突变pbase酶上与基因组靶位点dna相互结合的一些位点，可以保留pbase酶对pb转座子dna(transposon dna)的切割活性和itr结合能力，但几乎完全丧失将transposon dna整合到基因组“ttaa”位点的活性，可以改变转座子整合效率(“exc+int-”突变体)。并且有研究发现将相应的“exc+int-”突变体与cas9-grna结合可以将transposondna整合在grna导向的特定位点。但是仍然面临定点整合效率不高，且脱靶率较高的问题。

3、2013年美国实验室发表pbase论文(doi:10.1073/pnas.1305987110)，r372ak375a d450n突变体具有转座子供体dna切割活性，但“ttaa”整合能力很低。所以专利wo2020250181利用美国研究者的r372a k375a d450n这个突变体和cas9等核酸酶结合，具有靶向整合功能，并对pb突变体做了一些拓展。但现有技术尚缺整合效果更高且“ttaa”整合能力更低的pb突变体。

技术实现思路

1、针对现有技术中pbase定点整合效率不高且脱靶率较高的技术缺陷，本发明提供了一种pbase蛋白、融合蛋白、核酸、基因整合系统、基因递送系统和应用，所述pbase蛋白保留了结合piggybac转座子itr序列并切割以使piggybac转座子以线性的方式从供体质粒分离的能力，且所述pbase蛋白具有更低的“ttaa”上下游10bp以内的dna双链结合的能力。当所述pbase蛋白与位点特异性dna核酸酶连接制备得到融合蛋白，则pbase蛋白可以在位点特异性dna核酸酶产生的双链断裂处高效整合长片段外源基因，从而实现定点插入长片段基因的效果。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种pbase蛋白，所述pbase蛋白为在seq id no:3所示氨基酸序列的基础上，在以下氨基酸位点中的至少三个包含氨基酸突变：第166、286、289、302、315、347、375、376、441、450、498、520、521、523和557位，且所述pbase蛋白保留或增强基因整合能力，且所述pbase蛋白的target位点与识别能力降低。

3、所述基因整合能力体现为pbase的itr结合能力和切割转座子供体活性的综合。

4、本发明中，所述itr结合能力为pbase蛋白结合序列特异性的piggybac转座子itr的亲和力。

5、本发明中，所述切割转座子供体活性为pbase蛋白将piggybac转座子从对应的供体dna双链上剪切并使其游离出来的能力。

6、本发明中，所述target位点识别能力为pbase蛋白依靠自身的dna结合区域与靶位点“ttaa”上下游10bp以内的dna双链结合的能力。

7、较佳地，所述pbase蛋白为在seq id no:3所示氨基酸序列的基础上，在以下氨基酸位点中的至少一个包含氨基酸突变：r315、n347、k375和r376，还在以下氨基酸位点中的至少一个包含氨基酸突变：a166、n286、s289、g302、q441、d450、s498、e520、a521、t523和t557。其中，r315、n347、k375和r376上发生氨基酸突变可以降低所述pbase蛋白的target位点识别能力，a166、n286、s289、g302、q441、d450、s498、e520、a521、t523和t557上发生氨基酸突变可以提高所述pbase蛋白的itr结合能力或切割转座子供体活性。

8、较佳地，所述pbase蛋白在seq id no:3所示氨基酸序列的基础上，包括至少以下位点的氨基酸突变组合：

9、(1)r315、n347和d450；或

10、(2)n347、r376和d450。

11、较佳地，所述氨基酸突变为氨基酸替换，优选为如表1所示的氨基酸替换。

12、表1 pbase突变位点氨基酸替换

13、 位点 野生型的氨基酸残基 突变替换的氨基酸残基 166 a h,r,k 286 n h,r,k 289 s h,r,k 302 g h,r,k 315 r a,e,d 347 n s,t,y,q,c,g,a,e,d 375 k a,e,d 376 r a,e,d 441 q h,r,k 450 d n,s,t,c,y,a,r 498 s n 520 e h,r,k 521 a h,r,k 523 t r,n 557 t h,r,k

14、在本发明一较佳实施例中，所述pbase蛋白在seq id no:3所示氨基酸序列的基础上，包括至少以下氨基酸突变组合：

15、(1)r315a/e/d、n347s/t/y/q/c/g/a/e/d和d450n；或

16、(2)n347s/t/y/q/c/g/a/e/d、r376e和d450n。

17、更佳地，所述pbase蛋白在seq id no:3所示氨基酸序列的基础上，包括至少以下氨基酸突变组合：

18、(1)r315a、n347e和d450n；或

19、(2)n347a、r376e和d450n；或

20、(3)n347e、r376e和d450n。

21、更佳地，所述pbase蛋白在seq id no:3所示氨基酸序列的基础上，包括氨基酸突变组合n347a、r376e和d450n，还包括在如下氨基酸突变中一个或多个：a166h/r/k、n286h/r/k、s289h/r/k、g302h/r/k、q441h/r/k、s498n、e520h/r/k、a521h/r/k、t523r/n和t557h/r/k中突变。

22、进一步更佳，所述pbase蛋白在seq id no:3所示氨基酸序列的基础上，包括氨基酸突变组合n347a、r376e和d450n，还包括a166k、n286r、s289r、g302r、q441r、s498n、e520r、a521r、t523r和t557r中的一个或多个。

23、在本发明一具体实施方案中，所述pbase蛋白的氨基酸序列如seq id no:5、7或9所示。

24、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种融合蛋白，其包含融合至位点特异性dna核酸酶的如本文所述的pbase蛋白，且融合后不改变所述pbase蛋白和特异性dna核酸酶的原有功能。

25、本发明中，所述位点特异性dna核酸酶为具有特异性识别并结合核酸序列的功能且能在被识别的核酸序列切割产生双链断裂(dsb)的核酸酶，例如meganuclease、cas、zfn和talen。

26、本发明中，所述cas为可以产生定点dna双链断裂的crispr体系中的cas酶，常见的例如cas9和cas12，需要由引导rna(sgrna)介导识别靶向位点。

27、本发明中，所述zfn为锌指结构识别序列融合dna内切酶，如zinc-finger-foki。

28、本发明中，所述talen为转录激活因子样效应物识别序列融合内切酶，如tale-foki。

29、本发明中，所述meganuclease为具有较长识别序列的归巢核酸内切酶，如i-scei。

30、本发明中，所述pbase蛋白具有以下功能：将供体中目标基因插入所述位点特异性dna核酸酶产生的双链断裂中。

31、较佳地，所述融合蛋白中，所述位点特异性dna核酸酶和所述pbase蛋白以化学键直接相连或通过linker连接，所述linker优选为3*g4s，所述化学键优选为肽键。更佳地，所述通过linker连接的结构从n端到c端为：位点特异性dna核酸酶-linker-pbase蛋白。

32、更佳地，所述融合蛋白中，所述位点特异性dna核酸酶和所述pbase蛋白之间还包括flag序列，所述flag序列仅用于检测所述融合蛋白，并不影响所述融合蛋白的功能。

33、较佳地，所述特异性dna核酸酶包括nls序列，所述nls序列指核定位序列(nuclearlocalization sequence)，所述nls序列的氨基酸序列可如seq id no:1所示氨基酸序列的第1373-1379位。当所述特异性dna核酸酶包括nls序列时，所述融合蛋白的结构从n端到c端为：特异性dna核酸酶-nls-linker-pbase蛋白。

34、在本发明一具体实施方案中，所述融合蛋白中的所述pbase蛋白缺失氨基酸序列中第1位的甲硫氨酸(m)。

35、在本发明一具体实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:6、8或10所示。

36、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种分离的核酸，其编码如本文所述的pbase蛋白和/或如本文所述的融合蛋白。

37、在本发明一具体实例中，所述分离的核酸包括如seq id no:135-137的第4183-5964位所示的核苷酸序列，或所述分离的核酸包括如seq id no:135-137所示的核苷酸序列。

38、起始密码子atg编码的m在pbase蛋白成熟的过程中会被切除，且切除起始氨基酸m不影响pbase蛋白的功能；而融合蛋白中往往也不需要位于下游的pbase编码序列包含起始密码子atg。故所述分离的核酸可以在pbase的编码区域内的上游包括起始密码子atg，也可以不包括起始密码子atg。

39、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种基因整合系统，所述基因整合系统包括如本文所述的pbase蛋白或如本文所述的融合蛋白，或如本文所述的分离的核酸；以及，携带外源目的基因的piggybac转座子供体核酸。

40、较佳地，所述融合蛋白包括如本文所述的pbase蛋白和cas系统，所述cas系统包括cas蛋白酶和引导rna(sgrna)，所述cas蛋白酶例如cas9和cas12蛋白酶。

41、在本发明一具体实施方案中，所述piggybac转座子供体核酸中，所述外源目的基因的两侧有re itr和le itr序列，可以同时re itr，也可以同时为le itr，也可以分别为reitr和le itr。

42、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种基因递送系统，所述基因递送系统包含一个或多个载体，所述载体包含如本文所述的pbase蛋白、如本文所述的融合蛋白、如本文所述的分离的核酸和如本文所述的基因整合系统中的一种或多种，所述载体还包含携带外源目的基因的piggybac转座子供体核酸，所述载体例如腺病毒载体、脂质纳米粒、慢病毒载体、核糖核蛋白复合物和病毒样颗粒。

43、一种基因的整合方法，所述整合方法包括以下步骤：使用如本文所述的基因整合系统，将外源目的基因整合进宿主细胞的基因组中。

44、较佳地，所述基因整合系统是通过如本文所述的基因递送系统进入所述宿主细胞。

45、较佳地，所述方法为非诊断和/或治疗目的的。

46、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种药物组合物，其包含如本文所述的pbase蛋白、如本文所述的融合蛋白、如本文所述的分离的核酸、如本文所述的基因整合系统和如本文所述的基因递送系统中的一种或多种。

47、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种试剂盒，所述试剂盒包含如本文所述的pbase蛋白、如本文所述的融合蛋白、如本文所述的分离的核酸、如本文所述的基因整合系统、如本文所述的基因递送系统和如本文所述的药物组合物中的一种或多种。

48、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种套装药盒，所述套装药盒包含药盒a，所述药盒a包括如本文所述的pbase蛋白、如本文所述的融合蛋白、如本文所述的分离的核酸、如本文所述的基因整合系统、如本文所述的基因递送系统、如本文所述的药物组合物和如本文所述的试剂盒中的一种或多种。

49、较佳地，所述套装药盒还包括药盒b，所述药盒b包括检测或筛选基因整合是否成功的试剂，例如与被整合基因特异性结合的检测试剂，所述检测试剂例如探针和抗体。

50、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：如本文所述的pbase蛋白、如本文所述的融合蛋白、如本文所述的分离的核酸、如本文所述的基因整合系统、如本文所述的基因递送系统、如本文所述的药物组合物和如本文所述的试剂盒中的一种或多种在制备用于整合基因的试剂或治疗基因疾病的药物中的应用。

51、较佳地，所述应用为非诊断或治疗目的的。

52、较佳地，所述基因疾病例如大疱性表皮松解症。

53、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种整合基因或治疗基因疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的pbase蛋白、如本文所述的融合蛋白、如本文所述的基因整合系统、如本文所述的基因递送系统、如本文所述的药物组合物和如本文所述的试剂盒中的一种或多种。所述基因疾病例如大疱性表皮松解症。

54、为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：用于整合基因或治疗基因疾病的如本文所述的pbase蛋白、如本文所述的融合蛋白、如本文所述的基因整合系统、如本文所述的基因递送系统、如本文所述的药物组合物和如本文所述的试剂盒中的一种或多种。所述基因疾病例如大疱性表皮松解症。

55、本发明中，突变体以其包含的突变命名，突变的模板为野生型pbase(seq id no:3)，例如pbase n347a_r376e_d450n即为在seq id no:3的基础上，包括以下三个氨基酸突变：将第347位的n突变为a，将第376位的r突变为e，将第450位的d突变为n。

56、本发明所述pbase蛋白的制备可以按照本领域制备蛋白的常规方法。

57、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

58、本发明所用试剂和原料均市售可得。

59、本发明的积极进步效果在于：

60、本发明提供的pbase蛋白和现有技术的pbase突变体(例如r372a k375a d450n以及在它基础上进一步增加其他突变)相比，转座子dna切割活性更高(理论上切割活性高预示靶向整合效率高)，“ttaa”上下游10bp以内的dna双链结合的能力下降使得“ttaa”依赖性整合能力降低(理论上“ttaa”依赖性整合能力低预示脱靶更低)。当所述pbase蛋白与位点特异性dna核酸酶连接制备得到本发明所述的融合蛋白，则pbase蛋白可以在位点特异性dna核酸酶产生的双链断裂处高效整合长片段外源基因，从而实现定点插入长片段基因的效果。另外，本发明提供的种pbase蛋白、融合蛋白、核酸和基因整合系统相比于常规的同源重组可以实现更长长度的外源基因的敲入(例如可达12kb)，且可以使用环状质粒作为供体，简化了供体dna制备过程并降低成本，提高了产业应用的价值。