使用病毒载体构建体治疗法布里病的方法与流程

发明领域本公开涉及在有需要的受试者中治疗或改善法布里病(fabry disease)的一种或多种症状、降低鞘糖脂的量和/或增加α半乳糖苷酶a(α-gal a)蛋白活性的方法，所述方法通过施用治疗有效量的包含编码至少一种α-gal a蛋白的α半乳糖苷酶a(α-gal a)转基因的表达载体(例如腺相关病毒(aav)表达载体)来进行。

背景技术：

0、发明背景

1、法布里病为一种由α-半乳糖苷酶a(gla)缺乏产生的x连锁溶酶体贮积症。由此导致不能水解球形三酰神经酰胺(gb3)的末端α-半乳糖基部分，使得gb3在溶酶体中和细胞其他部位累积。早期特征临床表现包括重度神经性疼痛(肢端感觉异常)、皮肤病变(血管角质瘤)以及眼部体征(轮状角膜)。在以后的生活中，心脏、肾脏和脑血管并发症引起严重的发病率和缩短的寿命。desnick等,α-galactosidase adeficiency:fabry disease,beaudet等(编),the online metabolic and molecular bases of inherited disease,themcgraw-hill companies,inc.,new york,ny(2014)；van der veen sj等,mol genetmetab.126(2):162-168(2019)。

2、自2001年以来，法布里病患者用基于重组酶(半乳糖苷酶-α和半乳糖苷酶-β)的输注的两种不同的酶替代疗法(ert)进行了治疗。eng等,n engl j med 345:9-16(2001)；schiffmann等,jama 285:2743-2749(2001)；lenders等,j am soc nephrol.27(1):256-64(2016)。此类治疗只是为了治疗症状，而不是治愈性的，因此患者必须在其余生中重复给予这些蛋白质。

3、研究表明，输注重组酶的输注可引起抗gla中和抗体的形成，导致短期急性并发症，以及治疗抑制的有害长期效应，从而导致gb3和lyso-gb3消耗严重降低。lenders等,jam soc nephrol.27(1):256-64(2016)。在经典法布里病男性患者中，用ert治疗可延迟并发症的发生，尤其是在不可逆器官损伤发生之前开始治疗时。然而，用ert治疗的经典患病男性患者中有一半以上出现抗gla中和抗体。在女性患者和具有非经典疾病表型的患者中，很少观测到形成针对施用的重组酶的抗体。van der veen sj等,mol genet metab.126(2):162-168(2019)。

4、因此，仍然需要可用于治疗法布里病的非ert方法和组合物，包括通过基因组编辑进行的治疗，例如从而以治疗相关水平递送表达的转基因编码的基因产物。

技术实现思路

1、在一些方面中，本文提供了一种治疗有需要的人受试者的法布里病或改善与法布里病相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用包含α半乳糖苷酶a(α-gala)表达盒的腺相关病毒(aav)表达载体，所述α半乳糖苷酶a表达盒包含可操作地连接至α1-抗胰蛋白酶(haat)启动子的载脂蛋白e(apoe)增强子、人血红蛋白β(hbb)-igg内含子、编码信号肽的序列、编码至少一种α-gal a蛋白的α半乳糖苷酶a (α-gal a)转基因以及牛生长激素聚a信号序列，其中aav表达载体以约5×1012个载体基因组/千克体重(vg/kg)至约5×1013vg/kg的剂量施用。

2、在一些方面中，本文提供了一种治疗有需要的人受试者的法布里病或改善与法布里病相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用包含α半乳糖苷酶a(α-gala)表达盒的腺相关病毒(aav)表达载体，所述α半乳糖苷酶a表达盒包含编码至少一种α-gala蛋白的α半乳糖苷酶a (α-gal a)转基因，其中α-gala转基因包含如seq id no:5中所示的核苷酸序列，其中aav表达载体以约5×1012个载体基因组/千克体重(vg/kg)至约5×1013vg/kg的剂量施用。

3、在一些方面中，本文提供了一种降低有需要的人受试者中的鞘糖脂的量的方法，所述方法包括向受试者施用包含α半乳糖苷酶a(α-gal a)表达盒的腺相关病毒(aav)表达载体，所述α半乳糖苷酶a表达盒包含可操作地连接至α1-抗胰蛋白酶(haat)启动子的载脂蛋白e(apoe)增强子、人血红蛋白β(hbb)-igg内含子、编码信号肽的序列、编码至少一种α-gal a蛋白的α半乳糖苷酶a(α-gal a)转基因以及牛生长激素聚a信号序列，其中aav表达载体以约5×1012个载体基因组/千克体重(vg/kg)至约5×1013vg/kg的剂量施用，其中降低的鞘糖脂的量是相对于施用之前受试者中的鞘糖脂的量。

4、在一些方面中，本文提供了一种降低有需要的人受试者中的鞘糖脂的量的方法，所述方法包括向受试者施用包含α半乳糖苷酶a(α-gal a)表达盒的腺相关病毒(aav)表达载体，所述α半乳糖苷酶a表达盒包含编码至少一种α-gal a蛋白的α半乳糖苷酶a(α-gal a)转基因，其中α-gala转基因包含如seq id no:5中所示的核苷酸序列，其中aav表达载体以约5×1012个载体基因组/千克体重(vg/kg)至约5×1013vg/kg的剂量施用，其中降低的鞘糖脂的量是相对于施用之前受试者中的鞘糖脂的量。

5、在一些方面中，本文提供了一种增加有需要的人受试者中的α半乳糖苷酶a(α-gala)蛋白活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含α半乳糖苷酶a(α-gal a)表达盒的腺相关病毒(aav)表达载体，所述α半乳糖苷酶a表达盒包含可操作地连接至α1-抗胰蛋白酶(haat)启动子的载脂蛋白e(apoe)增强子、人血红蛋白β(hbb)-igg内含子、编码信号肽的序列、编码至少一种α-gal a蛋白的α-gal a转基因以及牛生长激素聚a信号序列，其中aav表达载体以约5×1012个载体基因组/千克体重(vg/kg)至约5×1013vg/kg的剂量施用，其中增加的α-gal a蛋白活性是相对于施用之前受试者中的α-gal a蛋白活性。

6、在一些方面中，本文提供了一种增加有需要的人受试者中的α半乳糖苷酶a(α-gala)蛋白活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含α半乳糖苷酶a(α-gal a)表达盒的腺相关病毒(aav)表达载体，所述α半乳糖苷酶a表达盒包含编码至少一种α-gal a蛋白的α-gal a转基因，其中α-gala转基因包含如seq id no:5中所示的核苷酸序列，其中aav表达载体以约5×1012个载体基因组/千克体重(vg/kg)至约5×1013vg/kg的剂量施用，其中增加的α-gal a蛋白活性是相对于施用之前受试者中的α-gal a蛋白活性。

7、在一些方面中，受试者患有法布里病。

8、在一些方面中，α-gal a表达盒还包含突变的土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)序列。

9、在一些方面中，突变的wpre序列包含mut6突变的wpre序列。

10、在一些方面中，α-gal a表达盒还包含可操作地连接至α1-抗胰蛋白酶(haat)启动子的载脂蛋白e(apoe)增强子、人血红蛋白β(hbb)-igg内含子、编码信号肽的序列以及牛生长激素聚a信号序列。

11、在一些方面中，转基因包含野生型α-gal a序列或密码子优化的α-gal a序列。

12、在一些方面中，信号肽为α-gala信号肽。

13、在一些方面中，增强子包含如seq id no:2中所示的核苷酸序列，启动子包含如seq id no:3中所示的核苷酸序列，内含子包含如seq id no:4中所示的核苷酸序列，α-gala转基因包含如seq id no:5中所示的核苷酸序列，突变的wpre序列包含如seq id no:6中所示的核苷酸序列，并且聚a信号序列包含如seq id no:7中所示的核苷酸序列。

14、在一些方面中，增强子包含如seq id no:2中所示的核苷酸序列，启动子包含如seq id no:3中所示的核苷酸序列，内含子包含如seq id no:4中所示的核苷酸序列，突变的wpre序列包含如seq id no:6中所示的核苷酸序列，并且聚a信号序列包含如seq id no:7中所示的核苷酸序列。

15、在一些方面中，α-gal a表达盒包含如seq id no:9中所示的核苷酸序列。

16、在一些方面中，aav表达载体血清型为aav2/6。

17、在一些方面中，α-gal a表达盒通过反向未端重复序列(itr)侧接在各个末端。在一些方面中，itr衍生自腺相关病毒2型(aav2)。在一些方面中，aav表达载体还包含通过衍生自aav2的itr侧接在各个末端的α-gal a表达盒，其中α-gal a表达盒用衍生自腺相关病毒6型(aav6)的衣壳包装。

18、在一些方面中，受试者具有以下症状中的一者或多者：球形三酰神经酰胺(gb3)水平高于正常值、球形三酰神经鞘氨醇(lyso-gb3)水平高于正常值、肾脏疾病、心脏疾病、无汗症、肢端感觉异常、血管角质瘤、胃肠道(gi)疼痛、角膜和晶状体浑浊或脑血管疾病。在一些方面中，血管角质瘤为脐周血管角质瘤。

19、在一些方面中，受试者具有小于约5％的α-gala蛋白活性。

20、在一些方面中，在受试者的血浆和/或白细胞中测量α-gala蛋白活性。

21、在一些方面中，受试者为男性受试者。在一些方面中，受试者为女性受试者。

22、在一些方面中，受试者具有指示法布里病的α-gala基因突变。在一些方面中，α-gala基因突变引起氨基酸突变g261d、c422t、w340r、s297y、q283x、d215s、ivs5/c.801+3a>g、p362l、c422t或n34s。

23、在一些方面中，如通过酶联免疫吸附分析(elisa)所确定，在施用之前受试者具有预先存在的抗α-gala抗体。

24、在一些方面中，当分析受试者的生物样品时，受试者为抗α-gala中和抗体阳性受试者，其中如通过抗α-gala中和抗体分析所测量，抗α-gala中和抗体阳性受试者具有α-半乳糖苷酶a活性抑制大于约9.6％的生物样品。

25、在一些方面中，从转基因表达的α-gal a蛋白使受试者中的鞘糖脂的量与施用之前受试者中的鞘糖脂的量相比降低至少约2倍。

26、在一些方面中，其中从转基因表达的α-gal a蛋白使受试者中的鞘糖脂的量与施用之前受试者中的鞘糖脂的量相比降低约百分之十(10％)、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。

27、在一些方面中，从转基因表达的α-gal a蛋白使受试者中的鞘糖脂的量维持在与施用之前相同的水平。

28、在一些方面中，鞘糖脂包含球形三酰神经酰胺(gb3)、球形三酰神经鞘氨醇(lyso-gb3)、半乳二糖神经酰胺或它们的任何组合。

29、在一些方面中，在受试者的血浆和/或尿液中测量gb3和/或lyso-gb3水平。

30、在一些方面中，在受试者的组织中测量gb3和/或lyso-gb3水平。

31、在一些方面中，从转基因表达的α-gal a蛋白使血浆、肝脏、心脏、肾脏、尿液、皮肤或脾脏中的一者或多者中的鞘糖脂的量降低。

32、在一些方面中，与施用之前受试者中的α-gal a蛋白活性相比，受试者中的α-gala蛋白活性介于比平均正常α-gal a蛋白活性高约0倍至高约2倍之间、高约2倍至高约5倍之间、高约5倍至高约10倍之间、高约10倍至高约20倍之间、高约20倍至高约30倍之间、高约30倍至高约40倍之间、高约30倍至高约40倍之间、高约40倍至高约50倍之间、高约50倍至高约60倍之间、高约60倍至高约70倍之间、高约70倍至高约80倍之间、高约80倍至高约90倍之间、高约90倍至高约100倍之间、高约100倍至高约200倍之间、高约200倍至高约300倍之间、高约300倍至高约400倍之间、高约400倍至高约500倍之间。

33、在一些方面中，与施用之前受试者中的α-gal a蛋白活性相比，受试者中的α-gala蛋白活性介于比平均正常α-gal a蛋白活性高约0倍至高约2倍之间、高约2倍、高约3倍、高约4倍、高约5倍、高约6倍、高约7倍、高约8倍、高约9倍、高约10倍、高约11倍、高约12倍、高约13倍、高约14倍、高约15倍、高约16倍、高约17倍、高约18倍、高约19倍、高约20倍、高约21倍、高约22倍、高约23倍、高约24倍、高约25倍、高约26倍、高约27倍、高约28倍、高约29倍、高约30倍、高约31倍、高约32倍、高约33倍、高约34倍、高约35倍、高约36倍、高约37倍、高约38倍、高约39倍、高约40倍、高约41倍、高约42倍、高约43倍、高约44倍、高约45倍、高约46倍、高约47倍、高约48倍、高约49倍、高约50倍、高约51倍、高约52倍、高约53倍、高约54倍、高约55倍、高约56倍、高约57倍、高约58倍、高约59倍、高约60倍、高约61倍、高约62倍、高约63倍、高约64倍、高约65倍、高约66倍、高约67倍、高约68倍、高约69倍、高约70倍、高约71倍、高约72倍、高约73倍、高约74倍、高约75倍、高约76倍、高约77倍、高约78倍、高约79倍、高约80倍、高约81倍、高约82倍、高约83倍、高约84倍、高约85倍、高约86倍、高约87倍、高约88倍、高约89倍、高约90倍、高约91倍、高约92倍、高约93倍、高约94倍、高约95倍、高约96倍、高约97倍、高约98倍、高约99倍或高约100倍。

34、在一些方面中，在受试者的血浆、血清、全血、干血点、白细胞或其他血液组分中的一者或多者中测量从转基因表达的α-gal a蛋白的水平。

35、在一些方面中，从转基因表达的α-gal a蛋白在受试者的肾脏、肝脏、皮肤以及心脏中为活性的。

36、在一些方面中，aav表达载体为肠胃外施用。在一些方面中，aav表达载体为静脉内施用。

37、在一些方面中，aav表达载体为在药学上可接受的载体中施用。在一些方面中，药学上可接受的载体包含含有cacl2、mgcl2、nacl、蔗糖以及kolliphor(泊洛沙姆(poloxamer))p 188的磷酸盐缓冲盐水。

38、在一些方面中，仅向受试者施用一个剂量的aav表达载体。在一些方面中，aav表达载体以约5×1012vg/kg的剂量施用。在一些方面中，aav表达载体以约1×1013vg/kg的剂量施用。在一些方面中，aav表达载体以约3×1013vg/kg的剂量施用。在一些方面中，aav表达载体以约5×1013vg/kg的剂量施用。

39、在一些方面中，在施用aav表达载体之前和/或期间为受试者施用免疫抑制剂。在一些方面中，免疫抑制剂包含泼尼松(prednisone)。

40、在一些方面中，在施用aav表达载体之前和/或期间受试者未施用免疫抑制剂。

41、在一些方面中，在施用aav表达载体之前受试者未施用预调理治疗。

42、在一些方面中，至少一种α-gal a蛋白的表达维持至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少19个月、至少20个月、至少21个月、至少22个月、至少23个月或至少24个月。

43、在一些方面中，在施用之后在受试者中通过使用慢性肾病流行病学协作组(ckd-epi)公式测量以ml/min/1.73m2计的估计肾小球滤过率(egfr)。在一些方面中，年egfr下降率低于类似的未治疗的患有法布里病的受试者。

44、在一些方面中，在施用之后在受试者中以每单位舒张末期左心室容积(lvedv)的每搏输出量(sv)的形式测量射血分数(ef)。在一些方面中，年ef下降率低于类似的未治疗的患有法布里病的受试者。

45、在一些方面中，在施用之后在受试者中通过二维(2d)应变超声心动图或心脏磁共振成像(心脏mri或cmr)测量总体纵向应变(gls)。在一些方面中，心脏肌肉收缩性的年缩短进展低于类似的未治疗的患有法布里病的受试者。

46、在一些方面中，在施用之后在受试者中通过基于心脏磁共振成像(心脏mri或cmr)的天然t1成像测量心肌的弛豫时间。在一些方面中，年弛豫时间减少低于类似的未治疗的患有法布里病的受试者。

47、在一些方面中，在施用之后在受试者中通过基于心脏磁共振成像(心脏mri或cmr)的t2成像以心肌中增加的水含量的形式测量水肿。在一些方面中，年水含量增加低于类似的未治疗的患有法布里病的受试者。

48、在一些方面中，在施用之后在受试者中以每单位体表面积的左心室质量(lvm)的形式测量左心室质量指数(lvmi)。在一些方面中，lvmi为年lvmi增加低于类似的未治疗的患有法布里病的受试者。

49、在一些方面中，在施用之后受试者的一种或多种听觉症状得以改善。在一些方面中，一种或多种听觉症状为耳鸣、头晕或进行性听力损失。

50、在一些方面中，受试者的出汗水平具有从无汗到少汗或正常发汗的正向变化。

51、在一些方面中，在施用之前受试者已施用针对法布里病的酶替代疗法(ert)(“预治疗”)。在一些方面中，酶替代疗法包含重组α-半乳糖苷酶a(gla)蛋白或表达gal的基因。在一些方面中，用于预治疗的酶替代疗法包括施用galafold、avr-rd-01、flt-190、培古尼加糖苷酶α(pegunigalsidase alfa)、4d-310或它们的任何组合。

52、在一些方面中，用于预治疗的酶替代疗法包含重组α-半乳糖苷酶a(gla)蛋白与gla的活性位点特异性伴侣(assc)的组合。在一些方面中，assc为1-脱氧半乳糖野尻霉素。

53、在一些方面中，用于预治疗的酶替代疗法包含半乳糖苷酶α和/或β或表达半乳糖苷酶α和/或β的基因。在一些方面中，用于预治疗的酶替代疗法包含fabrazyme、replagal、prx-102或它们的任何组合。

54、在一些方面中，用于预治疗的酶替代疗法包含基因疗法。在一些方面中，基因疗法包含编码酶的载体。在一些方面中，基因疗法包括施用avr-rd-01、flt-190、培古尼加糖苷酶α、4d-310或它们的任何组合。

55、在一些方面中，载体包含编码人gla蛋白或半乳糖苷酶α和/或β的mrna。在一些方面中，载体为病毒载体。在一些方面中，病毒载体包含腺相关病毒(aav)载体或慢病毒载体。在一些方面中，基因疗法通过脂质纳米颗粒递送。

56、在一些方面中，在施用之前受试者已施用针对法布里病的非酶替代疗法(“预治疗”)。在一些方面中，针对法布里病的预治疗疗法包含路切司他(lucerastat)、文鲁司他(venglustat)、阿帕他隆(apabetalone)或它们的任何组合。

57、在一些方面中，法布里病为1型经典表型或2型迟发性表型。