用于重组AAV生产的组合物和方法与流程

本公开涉及编码辅助功能的重组多核苷酸以及其在生产重组腺相关病毒(raav)颗粒的方法中的用途。相关申请的交叉引用本技术要求2021年10月5日提交的美国申请号63/252,585和2022年3月16日提交的美国申请号63/320,335的权益，所述申请各自以引用的方式整体并入本文。电子提交的序列表的引用与本技术一起提交的电子提交的序列表的内容(名称：6728_1802_sequence_listing.xml；大小：376,980字节；并且创建日期：2022年9月13日)以引用的方式整体并入本文。

背景技术：

1、基于重组腺相关病毒(aav)的载体目前是开发中的使用最广泛的基因治疗产品。raav载体系统的优选用途部分是由于缺乏与野生型病毒相关联的疾病、aav转导非分裂细胞和分裂细胞的能力以及在临床试验中观察到的所得的长期稳健的转基因表达，并且表明在基因疗法适应症中具有巨大的递送潜力。此外，不同的天然存在的和重组的raav载体血清型专门靶向不同的组织、器官和细胞，并且帮助逃避对所述载体的任何预先存在的免疫力，从而扩大了基于aav的基因疗法的治疗应用。在复制缺陷型病毒(例如，基于aav的基因疗法)可以更广泛地应用于后期临床阶段和商业用途之前，需要开发用于大规模生产重组病毒颗粒的新方法。

2、因此，本领域需要提高用于大规模生产raav颗粒的方法的生产率和产量。

技术实现思路

1、在一个方面，本公开提供了一种分离的重组多核苷酸，其包含以下中的一种或多种：a)编码腺病毒e2a dna结合蛋白(dbp)的核苷酸序列，其可操作地连接至第一启动子和第一polya信号；b)编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列，其可操作地连接至第二启动子和第二polya信号；以及c)编码腺病毒va rna i的核苷酸序列，其中所述分离的重组多核苷酸不包含编码腺病毒itr序列、l3 23k内切蛋白酶、l5 pvi/纤维和/或l4 pviii/六邻体相关前体的核苷酸序列。

2、在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒e2adbp的核苷酸序列、编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码腺病毒va rna i的核苷酸序列编码va rna i和va rna ii。

3、在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒e2adbp的核苷酸序列、编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列，其中编码腺病毒e2adbp的核苷酸序列和编码腺病毒e4 orf6和orf7的核苷酸序列处于相反的5’至3’方向。

4、在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸是包含细菌复制起点和选择性标记基因的质粒。

5、在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸包含与seq id no:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、41、42、43或51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。

6、在一些实施方案中，分离的重组多核苷酸包含seq id no:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、41、42、43或51的核苷酸序列。

7、在一个方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的分离的重组多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是hek293细胞、hek衍生细胞、cho细胞、cho衍生细胞、hela细胞、sf-9细胞、bhk细胞、vero细胞、细胞或perc6细胞。

8、在一个方面，本公开提供了一种生产本文所述的分离的重组多核苷酸的方法，其包括在合适的条件下孵育本文所述的宿主细胞。

9、在一个方面，本公开提供了一种生产重组腺相关病毒(raav)颗粒的方法，其包括培养能够生产raav颗粒的细胞，其中所述细胞包含：i)编码aav衣壳蛋白的多核苷酸；ii)编码功能性rep基因的多核苷酸；iii)包含有包含至少一个aav反相末端重复序列(itr)和编码基因产物的非aav核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非aav核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；以及iv)包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到aav衣壳中的条件下将基因组包装到aav衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成本文所述的分离的重组多核苷酸。

10、在一个方面，本公开提供了一种生产raav颗粒的方法，其包括：a)提供包含细胞的细胞培养物；b)将一种或多种多核苷酸引入到细胞中，所述一种或多种多核苷酸包含：i)编码aav衣壳蛋白的多核苷酸；ii)编码功能性rep基因的多核苷酸；iii)包含有包含至少一个aav反相末端重复序列(itr)和编码基因产物的非aav核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非aav核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；以及iv)包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到aav衣壳中的条件下将基因组包装到aav衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成本文所述的分离的重组多核苷酸；以及c)将细胞培养物维持在允许生产raav颗粒的条件下。

11、在一些实施方案中，本公开提供了：

12、[1.]一种分离的重组多核苷酸，其包含以下中的一种或多种：

13、a)编码腺病毒e2a dna结合蛋白(dbp)的核苷酸序列，其可操作地连接至第一启动子和第一polya信号；

14、b)编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列，其可操作地连接至第二启动子和第二polya信号；以及

15、c)编码腺病毒va rna i的核苷酸序列，

16、其中所述分离的重组多核苷酸不包含编码腺病毒itr序列、l323k内切蛋白酶、l5pvi/纤维和/或l4 pviii/六邻体相关前体的核苷酸序列；

17、[2.]如[1]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含：

18、a)编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列、编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

19、b)编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列以及编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列；

20、c)编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

21、d)编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

22、e)编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列；

23、f)编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列；或

24、g)编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

25、[3.]如[1]所述的分离的重组多核苷酸，其包含编码腺病毒e2adbp的核苷酸序列、编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列，其中编码腺病毒e2adbp的核苷酸序列和编码腺病毒e4 orf6和orf7的核苷酸序列处于相反的5’至3’方向；

26、[4.]如[1]至[3]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

27、[5.]如[1]至[3]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列包含seq id no:1；

28、[6.]如[1]至[5]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中腺病毒e2a dbp包含与seq id no:45具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

29、[7.]如[1]至[5]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中腺病毒e2a dbp包含seq id no:45的氨基酸序列；

30、[8.]如[1]至[7]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列与seq id no:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

31、[9.]如[1]至[7]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列包含seq id no:8；

32、[10.]如[1]至[9]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中腺病毒e4 orf6和orf7多肽包含与seq id no:46具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

33、[11.]如[1]至[9]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中腺病毒e4 orf6和orf7多肽包含seq id no:46的氨基酸序列；

34、[12.]如[1]至[11]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒va rnai的核苷酸序列包含与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

35、[13.]如[1]至[11]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒va rnai的核苷酸序列编码va rna i和va rna ii，并且任选地包含与seq id no:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

36、[14.]如[1]至[13]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子和第二启动子是不同的启动子；

37、[15.]如[1]至[14]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是腺病毒e2a启动子、cmv启动子或cmv衍生性启动子；

38、[16.]如[15]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是腺病毒e2a启动子；

39、[17.]如[16]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒e2a启动子包含与seqid no:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

40、[18.]如[16]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒e2a启动子包含seq idno:2的核苷酸序列；

41、[19.]如[15]至[18]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e2a启动子和e2a dbp的核苷酸序列包含与seq id no:3或4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

42、[20.]如[15]至[18]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e2a启动子和e2a dbp的核苷酸序列包含seq id no:3或4；

43、[21.]如[15]至[18]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e2a启动子和e2a dbp的核苷酸序列包含与seq id no:22或23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

44、[22.]如[15]至[18]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e2a启动子和e2a dbp的核苷酸序列包含seq id no:22或23；

45、[23.]如[1]至[14]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第一启动子是诱导型启动子；

46、[24.]如[1]至[23]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是腺病毒e4启动子、cmv启动子或cmv衍生性启动子；

47、[25.]如[24]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是腺病毒e4启动子；

48、[26.]如[25]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒e4启动子包含与seqid no:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

49、[27.]如[25]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒e4启动子包含seq idno:5的核苷酸序列；

50、[28.]如[1]至[23]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第二启动子是诱导型启动子；

51、[29.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

52、[30.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:10的核苷酸序列；

53、[31.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

54、[32.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:11的核苷酸序列；

55、[33.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码博卡病毒(boca virus)np1和ns2多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polya信号；

56、[34.]如[33]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码博卡病毒np1和ns2多肽的核苷酸序列与seq id no:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

57、[35.]如[33]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码博卡病毒np1和ns2多肽的核苷酸序列包含seq id no:12；

58、[36.]如[33]至[35]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是cmv启动子；

59、[37.]如[33]至[35]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

60、[38.]如[33]至[35]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:13的核苷酸序列；

61、[39.]如[33]至[38]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

62、[40.]如[33]至[38]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:14的核苷酸序列；

63、[41.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码腺相关病毒(aav)组装激活蛋白(aap)的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polya信号；

64、[42.]如[41]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码aav aap的核苷酸序列与seqid no:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

65、[43.]如[41]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码aav aap的核苷酸序列包含seq id no:15；

66、[44.]如[41]至[43]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是cmv启动子；

67、[45.]如[41]至[44]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

68、[46.]如[41]至[44]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:16的核苷酸序列；

69、[47.]如[41]至[46]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

70、[48.]如[41]至[46]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:17的核苷酸序列；

71、[49.]如[1]至[28]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其还包含编码腺病毒e1a多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子和第三polya信号；

72、[50.]如[49]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e1a多肽的核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

73、[51.]如[49]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码腺病毒e1a多肽的核苷酸序列包含seq id no:18；

74、[52.]如[49]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒e1a多肽包含与seq idno:51具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

75、[53.]如[49]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述腺病毒e1a多肽包含seq idno:51的氨基酸序列；

76、[54.]如[49]至[53]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述第三启动子是cmv启动子；

77、[55.]如[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

78、[56.]如[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:19的核苷酸序列；

79、[57.]如[49]至[56]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

80、[58.]如[49]至[56]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:20的核苷酸序列；

81、[59.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码e2a启动子、l4 22k/33k多肽和启动子、包含n末端缺失的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列，其中所述l4100k/六邻体组装多肽的所述n末端缺失对应于seq id no:21的核苷酸序列；

82、[60.]如[59]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码e2a启动子、l4 22k/33k多肽和启动子、包含n末端缺失的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列包含与seqid no:22具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

83、[61.]如[59]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码e2a启动子、l4 22k/33k多肽和启动子、包含n末端缺失的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列包含seq idno:22；

84、[62.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码e2a启动子、l4 22k/33k多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列；

85、[63.]如[62]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码e2a启动子、l4 22k/33k多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列包含与seq id no:23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

86、[64.]如[62]所述的分离的重组多核苷酸，其中编码e2a启动子、l4 22k/33k多肽和启动子、包含其起始密码子中的突变的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列包含seq id no:23；

87、[65.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码e2a启动子、l4 22k/33k多肽和启动子、包含n末端缺失的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列，其中所述l4100k/六邻体组装多肽的所述n末端缺失涵盖l4 100k/六邻体组装的起始密码子，但不涵盖所述l4 22k/33k多肽的起始密码子；

88、[66.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码e2a启动子、l4 22k/33k多肽和启动子、包含n末端缺失的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列，其中所述l4100k/六邻体组装多肽的全部或一部分是缺失的而不破坏l4 22k/33k起始密码子；

89、[67.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[45]至[50]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码e2a启动子、l422k/33k多肽和启动子、包含n末端缺失的l4 100k/六邻体组装多肽和e2a dbp的核苷酸序列，其中所述l4 100k/六邻体组装的所述n末端缺失从l4 100k/六邻体组装的起始密码子开始并且在紧邻l4 22k/33k启动子处结束；

90、[68.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[59]至[67]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:25、27、29、31或33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

91、[69.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[59]至[67]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:25、27、29、31或33的核苷酸序列；

92、[70.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[59]至[69]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:26、28、30、32或34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

93、[71.]如[1]至[27]、[33]至[36]、[41]至[44]和[49]至[54]以及[59]至[69]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:26、28、30、32或34的核苷酸序列；

94、[72.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列、编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

95、[73.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列和编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列；

96、[74.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列和编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

97、[75.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列和编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

98、[76.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列；

99、[77.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列；

100、[78.]如[1]至[71]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸包含编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

101、[79.]如[1]至[78]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其中所述分离的重组多核苷酸是包含细菌复制起点和选择性标记基因的质粒；

102、[80.]如[79]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述细菌复制起点是cole1起点；

103、[81.]如[79]或[80]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述选择性标记基因是药物抗性基因；

104、[82.]如[81]所述的分离的重组多核苷酸，其中所述选择性标记基因是卡那霉素抗性基因；

105、[83.]如[1]至[82]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:37-42或43具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

106、[84.]如[1]至[82]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:37-42或43的核苷酸序列；

107、[85.]如[1]至[82]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含与seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列；

108、[86.]如[1]至[82]中任一项所述的分离的重组多核苷酸，其包含seq id no:37的核苷酸序列；

109、[87.]一种宿主细胞，其包含如[1]至[86]中任一项所述的分离的重组多核苷酸；

110、[88.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞；

111、[89.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞；

112、[90.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞；

113、[91.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞；

114、[92.]如[87]所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是hek293细胞、hek衍生细胞、cho细胞、cho衍生细胞、hela细胞、sf-9细胞、bhk细胞、vero细胞、细胞或perc6细胞。

115、[93.]一种生产如[1]至[86]中任一项所述的分离的重组多核苷酸的方法，其包括在合适的条件下孵育如[87]至[92]中任一项所述的宿主细胞；

116、[94.]如[93]所述的方法，其包括在合适的条件下孵育如[88]或[89]所述的宿主细胞；

117、[95.]一种生产重组腺相关病毒(raav)颗粒的方法，其包括培养能够生产raav颗粒的细胞，其中所述细胞包含

118、i.编码aav衣壳蛋白的多核苷酸；

119、ii.编码功能性rep基因的多核苷酸；

120、iii.包含有包含至少一个aav反相末端重复序列(itr)和编码基因产物的非aav核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非aav核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；

121、iv.包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到aav衣壳中的条件下将基因组包装到aav衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成如[1]至[86]中任一项所述的分离的重组多核苷酸；

122、[96.]如[95]所述的方法，其中包含足够的辅助功能的所述一种或多种多核苷酸包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列、编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

123、[97.]一种生产raav颗粒的方法，其包括

124、a)提供包含细胞的细胞培养物；

125、b)将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，所述多核苷酸包含：

126、i.编码aav衣壳蛋白的多核苷酸；

127、ii.编码功能性rep基因的多核苷酸；

128、iii.包含有包含至少一个aav反相末端重复序列(itr)和编码基因产物的非aav核酸序列的基因组的多核苷酸，所述非aav核酸序列可操作地连接至指导基因产物在靶细胞中表达的序列；和

129、iv.包含足够的辅助功能以允许在允许将基因组包装到aav衣壳中的条件下将基因组包装到aav衣壳蛋白中的一种或多种多核苷酸，其中包含足够的辅助功能的一种或多种多核苷酸独立地构成如[1]至[86]中任一项所述的多核苷酸；以及

130、c)将细胞培养物维持在允许生产raav颗粒的条件下；

131、[98.]如[97]所述的方法，其中包含足够的辅助功能的所述一种或多种多核苷酸包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码腺病毒e2a dbp的核苷酸序列、编码腺病毒e4 orf6和orf7多肽的核苷酸序列以及编码腺病毒va rna i的核苷酸序列；

132、[99.]如[97]或[98]所述的方法，其包括将编码aav衣壳蛋白和功能性rep基因的多核苷酸引入到细胞中；

133、[100.]如[97]至[99]中任一项所述的方法，其中通过转染将一种或多种多核苷酸引入到细胞中；

134、[101.]如[95]至[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞；

135、[102.]如[95]至[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞；

136、[103.]如[95]至[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是hek293细胞、hek衍生细胞、cho细胞、cho衍生细胞、hela细胞、sf-9细胞、bhk细胞、vero细胞、细胞或perc6细胞；

137、[104.]如[95]至[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是hek293细胞；

138、[105.]如[95]至[104]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮培养物或贴壁培养物；

139、[106.]如[95]至[105]中任一项所述的方法，其还包括回收raav颗粒。

140、[107.]如[95]至[105]中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产更多的以gc/ml测量的raav颗粒，所述参考方法使用包含辅助功能且包含seq id no:44的核苷酸序列的多核苷酸；

141、[108.]如[95]至[105]中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产至少约两倍的以gc/ml测量的raav颗粒，所述参考方法使用包含辅助功能且包含seq idno:44的核苷酸序列的多核苷酸；

142、[109.]如[95]至[105]中任一项所述的方法，其中所述方法与参考方法相比生产包含更多完整衣壳的raav颗粒群体，所述参考方法使用包含辅助功能且包含seq id no:44的核苷酸序列的多核苷酸；

143、[110.]如[95]至[109]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约50升与约20,000升之间的体积。

144、[111.]如[95]至[110]中任一项所述的方法，其中所述raav颗粒包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15和aav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aavmyo、myoaav.1a、myoaav1c、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15或aav.hsc16血清型的衣壳蛋白；

145、[112.]如[95]至[110]中任一项所述的方法，其中所述raav颗粒包含aav8、aav9、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1或aav.hu37血清型的衣壳蛋白；

146、[113.]如[95]至[110]中任一项所述的方法，其中所述raav颗粒包含aav8或aav9血清型的衣壳蛋白；

147、[114.]如[95]至[110]中任一项所述的方法，其中所述基因产物是多肽或双链rna核酸；

148、[115.]如[114]所述的方法，其中所述基因产物是多肽；

149、[116.]如[115]所述的方法，其中所述基因产物是抗vegf fab、抗激肽释放酶抗体、抗tnf抗抗体、微小肌营养不良蛋白(microdystrophin)、微型肌营养不良蛋白(minidystrophin)、艾杜糖苷酶(idua)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids)、低密度脂蛋白受体(ldlr)、三肽基肽酶1(tpp1)或vegf受体1(sflt-1)的非膜相关剪接变体；

150、[117.]如[115]所述的方法，其中所述基因产物是γ-肌聚糖、rab护卫蛋白1(rep1/chm)、类维生素a异构水解酶(rpe65)、环状核苷酸门控通道α3(cnga3)、环状核苷酸门控通道β3(cngb3)、芳香族l-氨基酸脱羧酶(aadc)、溶酶体相关膜蛋白2同种型b(lamp2b)、因子viii、因子ix、色素性视网膜炎gtp酶调节剂(rpgr)、视网膜劈裂蛋白(rs1)、肌浆网钙atp酶(serca2a)、阿柏西普(aflibercept)、巴登氏病蛋白(battenin，cln3)、跨膜er蛋白(cln6)、谷氨酸脱羧酶(gad)、胶质细胞系源性神经营养因子(gdnf)、水通道蛋白1(aqp1)、肌营养不良蛋白、肌微管素1(mtm1)、卵泡抑素(fst)、葡萄糖-6-磷酸酶(g6p酶)、载脂蛋白a2(apoa2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1a1(ugt1a1)、芳基硫酸酯酶b(arsb)、n-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(naglu)、α-葡萄糖苷酶(gaa)、α-半乳糖苷酶(gla)、β-半乳糖苷酶(glb1)、脂蛋白脂肪酶(lpl)、α1-抗胰蛋白酶(aat)、磷酸二酯酶6b(pde6b)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9otc)、运动神经元生存蛋白(survival motor neuron，smn1)、运动神经元生存蛋白(smn2)、神经秩蛋白(nrtn)、神经营养蛋白3(nt-3/ntf3)、胆色素原脱氨酶(pbgd)、神经生长因子(ngf)、线粒体编码的nadh:泛醌氧化还原酶核心亚基4(mt-nd4)、保护性蛋白组织蛋白酶a(ppca)、戴斯弗林蛋白(dysferlin)、mer原癌基因、酪氨酸激酶(mertk)、囊性纤维化跨膜传导调节物(cftr)或肿瘤坏死因子受体(tnfr)-免疫球蛋白(igg1)fc融合物。

151、[118.]如[115]所述的方法，其中所述基因产物是肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白；

152、[119.]如[114]所述的方法，其中所述基因产物是微小rna。

153、当结合附图阅读时，本文所述的组合物和方法的另一些其他特征和优点将从以下具体实施方式变得更加清楚。