一种用于废水处理的复合微生物菌剂的制备及应用方法

本发明涉及复合微生物菌剂的制作及废水处理，具体提供一种高效处理废水的复合微生物菌剂制备及应用方法。

背景技术：

1、随着我国城市化的发展，大量污水的产生导致生态环境受到严重影响。目前，污水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法是最基本的处理方法，采用物理或者机械方法对污水进行处理；化学法主要利用絮凝剂等化学物质与污水中的污染物进行反应使污染物加以去除，但是易导致二次污染；生物法是现在应用最广泛的处理技术，以污染物作为微生物生长繁殖和代谢的养分从而将污染物去除，这种方法主要包括活性污泥法和生物膜法，通常被认为是污染小、成本低的可持续技术。但是，传统的生物法存在工艺流程长，占地面积大，处理效率低的问题。因此，微生物强化技术应运而生，作为一种提高生物系统稳定性的方法成为污水处理的新方法。

2、目前，生物强化技术主要包括：直接投加优势菌种、生物强化菌剂和固定化生物强化。其中直接投加优势菌种是直接投加适量的高效降解菌，有针对性且高效地去除污水中的污染物；生物强化菌剂对成分复杂的生活污水表现出有针对性的降解能力，可以缩减微生物驯化的时间，短时间内提高微生物浓度，增强生物处理系统稳定性；固定化生物强化是通过吸附法、交联法、包埋法等，将微生物附着于载体上，帮助其成为优势菌种，从而提高污染物降解效率，而且在污水处理厂的长期运作中，可以提高微生物细胞的利用率以及回收率，因此在水污染治理中得到了广泛的运用。

3、复合微生物菌剂是从自然环境中筛选出一系列能降解有机物的有效菌株，对其进行针对性的驯化和培养，形成能有效降解某些有机物的有利菌群，再将这些有利菌群组合。这样制备出来的微生物菌群可以提高微生物的活性和数量，加速有机污染物的降解。本发明旨在将活性污泥中起污水净化作用的主要菌群进行筛选，将主要的微生物复配成复合微生物菌剂，再利用固定化生物强化技术来提高菌剂去除cod和氨氮的效率。利用这种特定的固定化微生物菌剂来代替污泥，即可避免活性污泥的二次污染或处理成本，从而减少污水处理的成本，且更有针对性的处理污水，具有很高的实用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高效处理废水的复合微生物菌剂制备及应用方法，该方法能较大减少甚至不用活性污泥，对污水cod和氨氮降解效果更显著，使用更加便捷，成本较小，对其他微生物菌剂的制作和污水的处理具有很好的借鉴和推广价值。

2、本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：

3、一种高效处理废水的复合微生物菌剂制备及应用方法，其特征在于：所述制备方法的步骤为：

4、步骤1：对污泥样品中的菌群增殖培养，并用划线法进行单菌落分离：

5、步骤2：从上述划线后的培养基内挑取单菌落，进行培养；

6、步骤3：单菌落培养后进行16s rdna pcr扩增，测序后构建系统发育树，得到菌株的物种鉴定结果，后用生理生化指标实验进行验证；

7、步骤4：配置人工污水进行单菌株摇瓶实验，验证cod及氨氮降解效果；

8、步骤5：进行多菌种组合摇瓶实验，选取出最好的处理效果的优势菌种组合，后调节优势菌株的加入比例，得出复合微生物菌剂配方；

9、步骤6：制备固定化微生物菌剂，测定固定化微生物菌剂在污水处理中cod、氨氮的去除效果。

10、进一步的，所述步骤1包括：

11、(1)将现场取得的氯碱污水处理厂中的污泥样品用pbs缓冲溶液稀释为混悬液，稀释倍数为10倍；

12、(2)配制增殖液体培养基，配方为葡萄糖(0.5-10.0g)，可溶性淀粉(0.5-10.0g)，ch3coona(0.1-5.0g)，nh4cl(0.1-2.0g)，蛋白胨(0.1-10.0g)，牛肉膏(0.1-5.0g)，(nh4)2so4(0.05-5.0g)，kh2po4(0.1-5.0g)，na2co3(0.1-5.0g)，加蒸馏水定容至1l，配置后进行30min超声，经高压蒸汽灭菌锅灭菌后放入4℃冰箱保存备用；

13、(3)将稀释后的污泥混悬液以增殖液体培养基的1-3％比例加入，在37℃下，200r/min摇床培养24-72h，观察菌种的生长；

14、(4)当菌液明显浑浊时，蘸取培养液稀释，稀释倍数为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，将增殖液体培养基加入2％琼脂制作固体培养基，将稀释后的各梯度菌液用已灭菌的接种环在固体培养基上划线，每个梯度划2个，在30-37℃条件下倒置培养24-72h。

15、进一步的，所述步骤2中观察不同平板菌种的生长情况，确认稀释的最佳梯度，挑取单菌落并接入步骤1所配置的增殖液体培养基中，在30-37℃条件下恒温培养24-72h。

16、进一步的，所述步骤3包括：

17、(1)将纯化后的菌株取出，使用艾克瑞生物的细菌基因组dna提取试剂盒，提取菌株基因组dna，将提取后的基因组dna进行pcr扩增，取pcr产物测序后，用ncbi blast程序将拼接后的序列文件与美国国立生物技术信息中心(ncbi)数据库进行比对，选择相似度较高的序列进行同源性比对，利用mega 5.05的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树；

18、所用的引物序列如下：正向引物27f：5′-agagtttgatcmtggctcag-3′，反向引物1492r：5′-ggttaccttgttacgactt-3′；

19、表1 pcr的反应体系

20、

21、反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸90s，循环30次，72℃延伸8min；

22、(2)测序后通过ncbi查找与测量物种序列相似性最大的物种信息并构建系统发育树，得到菌株的16s rdna物种鉴定结果；

23、表2菌株16s rdna物种鉴定的主要结果

24、

25、

26、(3)用生理生化指标实验进行验证，如生长温度验证、生长盐度验证、葡萄糖发酵试验、v-p试验、淀粉水解试验、明胶水解实验、接触酶试验等。

27、进一步的，所述步骤4包括：

28、(1)配置人工污水，配方为葡萄糖(0.5-10.0g)，可溶性淀粉(0.5-10.0g)，ch3coona(0.1-5.0g)，nh4c1(0.1-2.0g)，蛋白胨(0.1-10.0g)，牛肉膏(0.1-5.0g)，(nh4)2so4(0.05-5.0g)，kh2po4(0.1-5.0g)，na2co3(0.1-5.0g)，加蒸馏水定容至1l：

29、(2)经超声及灭菌后分装，将单菌株菌液以人工污水0.2-1％的比例加入进行培养，以不接入菌株的人工污水为对照，在30-37℃条件下，摇床培养，测量其刚接入及接入3天后的cod及氨氮数据，验证各个菌株降解cod及氨氮的能力。

30、进一步的，所述步骤5中将各个单菌株菌液以人工污水0.5-2％的比例加入，进行不同组合的实验；在30-37℃条件下摇床培养，测量其刚接入及接入3天后的cod及氨氮数据，选取出处理效果最好的微生物菌剂配比组合；后通过正交实验，观察k、r的变化，调节优势菌株的加入比例，得出复合微生物菌剂配方。

31、进一步的，所述步骤6中所述制备固定化微生物菌剂的固定化材料为海藻酸钠(sa)，同时选取活性炭这种具有较高孔隙率和较大比表面积的材料作为微生物菌液的吸附材料，其可以产生很强的静电力场，吸附及固定微生物；

32、固定化微生物菌剂的制备方法如下：

33、(1)称取cacl2于烧杯中，加水溶解，配制成一定质量分数的cacl2溶液(2％～8％)；

34、(2)将海藻酸钠加热并不断搅拌，使其溶于超纯水中，最终浓度为2％～4％，冷却至室温；

35、(3)将已灭菌并烘干至恒重的活性炭，按一定占菌液比加入到微生物菌液中，充分摇匀混合后在37℃下静置24h，滤过多余菌液，将吸附菌液后的活性炭加入到海藻酸钠溶液中；

36、(4)待活性炭及海藻酸钠充分混匀后，通过挤压滴落法，用针型注射器将混合物缓慢、均匀地滴入cacl2溶液中，再置于冰箱内4℃环境下交联24-48h，取出并用超纯水洗涤三次，得到固定化微生物菌剂。

37、本发明具有以下有益效果：

38、本发明用于废水处理的复合微生物菌剂的制备及应用方法，与传统的活性污泥法相比有较大节约成本、保护环境的空间，同时也比现有其余使用微生物菌剂净化污水的技术更具独创性，将生物强化菌剂法和固定化生物强化法相结合，污水中cod和氨氮降解效果更显著，处理效率更高，使用更加便捷，具有很好的借鉴和推广价值。