一种全集成微流控核酸分析芯片及核酸分析方法

本发明属于微流控芯片领域，更具体地，涉及一种全集成微流控核酸分析芯片及核酸分析方法。

背景技术：

1、随着荧光定量pcr技术的普及，分子检测在临床医学、环境监测等领域得到了广泛应用。然而，当前主流的分子诊断平台仍存在一定的局限性：(1)为了规避气溶胶污染和样本交叉污染，需要在专业人员在标准的pcr实验室不同独立房间内严格实施试剂准备、核酸提取和扩增，极大限制了在医疗资源有限及即时检测的情况下应用；(2)采用离线式分析，操作繁琐、分析周期较长，不利于应对紧急突发事件，难以满足现场快速检测及医院门急诊场景下的“随到随检、快速响应”需求；(3)病原菌种类繁多，现行方法大多针对单一指标进行检测，无法快速高效筛查病原菌。

2、当前，为实现核酸检测的全自动化检测，传统方法采用机械臂工作站，将原先手动操作的三个功能分区的房间微缩至一台仪器上。然而，这种方式依然面临着气溶胶污染的挑战。具体来说，在扩增过程中，阳性样本反应管内的靶基因片段浓度极高，同时pcr反应温度也很高。这时候，如果pcr反应管漏气，靶基因片段会随水蒸气扩散至空气中，形成dna气溶胶污染。因此，整个仪器都充满了靶基因片段。针对这一问题，研发人员提出了多种解决方案。这些方案主要采用分舱设计，将提取和扩增分别放置在一个密封舱和另一个密封舱中，并保持扩增舱负压。相当于将标准pcr实验室的部分功能集成到一台机器上。为了规避气溶胶污染，还需采取一些措施，如使用低温等温扩增，利用固态石蜡密封扩增管；在扩增管传递至扩增舱之前，用一层塑料薄膜进行热封，确保pcr扩增过程中不会泄漏气溶胶等。此外，还有一些标准措施，如uv光照和气溶胶过滤膜等。

3、机械臂全自动核酸检测工作站设备通常较大，侧重于样本检测通量高，更适用于大医院检验科里的多样本、少指标检测的应用场景，而在poct(point-of-care testing，即时检验)级别的全自动核酸检测领域则并不适用，全集成微流控技术就是为了解决上述痛点应运而生的。微流控芯片可以实现样本进-结果出的核酸分子检测，即将核酸提取、扩增和检测过程集成于同一设备中，从而摆脱繁琐的操作流程和对专业实验室的依赖，并且，由于整个反应过程在封闭环境中进行，微流控芯片技术能够有效降低交叉污染及病原菌外溢的风险。随着微流控芯片技术的不断发展，各种微流控技术和生物传感技术不断涌现，各类新材料、新方法和新设备层出不穷，这些创新推动了分子诊断技术的发展，使得核酸分析从繁琐的实验室操作逐步转变为便捷高效的自动化检测。

4、然而，要实现全集成的样本进-结果出核酸分子检测，仍然面临诸多挑战。首要问题在于，核酸检测涉及到样本裂解、核酸捕获、清洗、洗脱、定量和扩增等一系列繁琐的步骤，如何在一个紧凑的平台上实现核酸提取、扩增、检测和数据分析的高度集成，并且严格保证各流程的执行顺序以确保检测结果的准确性和灵敏度，是一个亟需攻克的技术难点。

5、在申请号为2020103083980、名称为“一种全流程生物检测装置”的发明专利中，公开了一种高度集成化的全流程生物检测装置，将生物细胞或生物颗粒的裂解、纯化、扩增与检测集成于一体，实现了对生物大分子(如核酸)的全封闭检测分析与检测全流程的一体化整合；其用于核酸分析时，清洗液、洗脱液均需通过液体控释单元释放，其中的液体控释单元具体包括开设于反应器上的导流槽和密封覆盖于导流槽上方的用于储存液体的可压缩的储液容器，储液容器包括位于反应器外侧的韧性上盖以及位于韧性上盖和导流槽之间的脆性底托，脆性底托封堵于导流槽的上端开口并且与韧性上盖包围形成用于储存液体的密闭腔体，脆性底托的断裂强度小于韧性上盖的断裂强度，当脆性底托受到的液体压力大于等于自身的断裂强度时，脆性底托发生破裂并将储液容器和导流槽连通。该液体控释单元的制作难度较大，制作成本较高，在实际应用中，依据材料的断裂强度控制液体的释放，控制难度较大。此外，对于多种液体的释放顺序也无法实现精确控制，例如，在通过离心控制清洗液的释放时，存储有洗脱液的液体控释单元内的底托也可能在离心作用下发生断裂，而导致洗脱液提前释放。

6、总的来说，现有的集成式核酸分析芯片，在流程控制及分析结果方面，仍有待进一步提高。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷和改进需求，本发明提供了一种全集成微流控核酸分析芯片及核酸分析方法，其目的在于，提出一种可集成核酸纯化、清洗、洗脱、分液定量及扩增全流程，且控制难度低，分析精度高的全集成微流控核酸分析芯片。

2、为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种全集成微流控核酸分析芯片，包括：围绕同一离心轴设置的一个或多个分析单元；分析单元包括：

3、样品腔室，以及其后设置的一级或多级清洗液腔室；样品腔室的底端与其后相邻的清洗液腔室顶端通过微通道相连；相邻两级清洗液腔室间，前一级清洗液腔室的底端与后一级清洗液腔室的顶端通过微通道相连；

4、洗脱液腔室；

5、核酸提取腔室，其内置有核酸捕获单元；样品腔室以及各级清洗液腔室底端均通过微通道与核酸提取腔室顶端相连；洗脱液腔室底端通过第一可控阀门与核酸提取腔室顶端相连；

6、流体切换腔室，其顶端与核酸提取腔室的底端相连；

7、第一废液腔室，与流体切换腔室的底端相连；

8、预收集腔室，与流体切换腔室的底端相连，且与第一废液腔室分别位于流体切换腔室的两侧；

9、以及扩增反应模块，其通过第二可控阀门与预收集腔室相连，用于进行定量和扩增反应。

10、进一步地，第一可控阀门包括第一虹吸管和第一气动腔室；

11、第一虹吸管和第一气动腔室分别位于洗脱液腔室两侧；第一虹吸管的顶端高于洗脱液腔室的顶端，且第一虹吸管与核酸提取腔室顶端相连。

12、进一步地，第二可控阀门包括第二虹吸管和第二气动腔室；

13、第二虹吸管和第二气动腔室分别位于预收集腔室两侧；第二虹吸管的顶端高于预收集腔室的顶端，且第二虹吸管与扩增反应模块相连。

14、进一步地，在连接样品腔室和清洗液腔室的微通道以及连接相邻清洗腔室的微通道的首端，均设置有防水透气膜。

15、进一步地，核酸提取腔室内的核酸捕获单元为硅胶膜。

16、进一步地，扩增反应模块包括：

17、引流通道，其首端与第二可控阀相连；

18、沿引流通道外侧设置的一个或多个定量腔室；

19、与定量腔室一一对应且设置于对应定量腔室下游的一个或多个扩增腔室，各扩增腔室的顶端通过微通道与对应定量腔室的底端相连；

20、以及与引流通道末端相连的第二废液腔室。

21、进一步地，用于连接定量腔室及对应扩增腔室的微通道首端开口处预封装有可牺牲材料。

22、按照本发明的另一个方面，提供了一种基于上述全集成微流控核酸分析芯片的非医学诊断目的的核酸分析方法，样品腔室中预封装有样本裂解液，各清洗液腔室中预封装有清洗液，洗脱液腔室中预封装有洗脱液，各扩增腔室中预埋有冻干试剂；

23、核酸分析方法包括如下步骤：

24、(s1)以第一转速旋转核酸分析芯片，直至样品腔室和各级清洗液腔室中的液体依次流过提取单元；在第一转速下，样品腔室和清洗液腔室中的液体可突破底端的微通道，但洗脱液腔室中的液体不能突破第一可控阀，同时，旋转离心产生的科氏力由流体切换腔室指向第一废液腔室；

25、(s2)以第二转速旋转核酸分析芯片，直至核酸提取腔室中的液体均转移至第一废液腔室；在第二转速下，洗脱液腔室中的液体不能突破第一可控阀，同时，旋转离心产生的科氏力由流体切换腔室指向第一废液腔室；

26、(s3)以第三转速旋转核酸分析芯片，并进行急加减速，使洗脱液腔室中的洗脱液突破第一可控阀门；

27、(s4)以第四转速旋转核酸分析芯片，使洗脱液腔室中的洗脱液进入核酸提取腔室，并全部转移至预收集腔室中；在第三转速下，旋转离心产生的科氏力由流体切换腔室指向预收集腔室，且预收集腔室中的液体不能突破第二可控阀门；

28、(s5)以第五转速旋转核酸分析芯片，并急加减速，使预收集腔室中的液体突破第二可控阀；

29、(s6)以第六转速旋转核酸分析芯片，使预收集腔室中的液体转移至扩增反应模块，实现定量和扩增反应；

30、(s7)读取扩增反应模块中的反应结果，完成分析。

31、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案，能够取得以下有益效果：

32、(1)本发明提供的全集成微流控核酸分析芯片，其中样品腔室及其后各级清洗液腔室的底端均与下游的提取腔室相连，且相邻两级腔室中，前一级腔室的底端通过微通道与后一级腔室的顶端相连，通过这种结构设计，使得芯片离心过程中，可利用气压平衡原理，实现样品腔室及其后各级清洗液腔室中液体的逐级释放；洗脱液腔室则通过可控阀与下游的提取腔室相连，使得洗脱液的释放可按需独立控制，待残留清洗液完全排除后再释放洗脱液，从而核酸分析中各流程按照严格的顺序执行，保证了核酸分析结果的准确性和可靠性。通过转速控制，核酸分析的整个流程即可在芯片上完成，并且控制难度低，分析精度高。总体而言，本发明通过对芯片结构的改进，可以对核酸分析过程中反应液体的释放进行优化，有效提高芯片内核酸分析的效率、精度和可靠性。

33、(2)在本发明的优选方案中，洗脱液腔室和提取腔室之间，以及流体切换腔室和预收集腔室之间通过气动虹吸阀连接，通过控制离心，即可方便地控制腔室之间的连通。

34、(3)在本发明的优选方案中，在连接样品腔室和清洗液腔室的微通道以及连接相邻清洗腔室的微通道的首端，均设置有防水透气膜，这种膜材料能够允许气体自由进入，同时阻止核酸分子的溢出，从而可以有效地避免气溶胶污染，并保证液体的顺序释放。

35、(4)在本发明优选的方案中，采用硅胶膜作为提取单元中的核酸捕获单元，实现对核酸的高效吸附和分离，规避了复杂磁控操作，也更利于将提取介质封装于芯片上。