一种观蓝发酵培养基及发酵方法与流程

本发明涉及微生物发酵生产，具体涉及一种观蓝发酵培养基及发酵方法。

背景技术：

1、观蓝是一种天然的微生物蓝色产物，可作为传统工业染料靛蓝的替代品应用于染料行业，具有安全、环保、抗菌等优点。

2、当前传统工业靛蓝主要通过化学法进行人工合成，多以有机化合物苯胺为原料进行合成，对人体危害，合成过程中产生的废酸与高盐废水对环境危害极大。微生物发酵法生产观蓝因其设备简单、污染小、成本低等优势已逐步成为工业靛蓝的替代方案，且观蓝较于传统靛蓝色素色泽更为明亮深邃，在染料行业应用更具优势。

3、目前业内使用微生物发酵法生产观蓝的产量普遍偏低，发酵周期较长，此外发酵使用的培养基多为lb、zym等高成本培养基，暂时无法进行工业化生产。因此现在急需一种针对观蓝工业化生产的培养基及其配套的发酵方法，以解决观蓝发酵产量低、成本高、周期长的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种观蓝发酵培养基及发酵方法，通过优化观蓝发酵培养基的原料及组成，降低发酵成本，大幅提高了观蓝产量和转化率，缩短了发酵周期，有利于观蓝的工业化生产。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种观蓝发酵培养基，包括基础发酵培养基和补料培养基；所述基础发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖5-10g/l，胰蛋白胨3-8g/l，玉米浆干粉5-10g/l，十二水合磷酸氢二钠2-3g/l，磷酸二氢钾1-2g/l，氯化铵1-2g/l，七水硫酸镁0.5-1.5g/l，消泡剂0.2-0.5ml/l；所述补料培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖400-600g/l，玉米浆干粉3-8g/l，氯化铵5-15g/l。

4、本发明对现有的观蓝发酵培养基的配方进行了优化，其中，葡萄糖为碳源，胰蛋白胨、玉米浆干粉为有机氮源，十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾用于维持渗透压，氯化铵为无机氮源、七水硫酸镁为辅因子，消泡剂用于消除泡沫。本发明的发酵培养基采用了更为廉价的原料，降低了发酵的成本。上述组分在本发明的范围内，均能提高发酵观蓝的产量。

5、优选地，所述基础发酵培养基的初始ph为7.0。

6、优选地，所述消泡剂为聚醚消泡剂，主要成分为聚氧丙烯、聚氧乙烯与引发物的缩合物。

7、优选地，所述基础发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖8g/l，胰蛋白胨5g/l，玉米浆干粉7g/l，十二水合磷酸氢二钠2.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，氯化铵1.5g/l，七水硫酸镁1g/l，消泡剂0.2ml/l；所述补料培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖500g/l，玉米浆干粉5g/l，氯化铵10g/l。

8、本发明的发酵培养基为上述的特定的组成时，可大幅提高观蓝产量，观蓝产量最高达到10.26g/l。

9、第二方面，本发明提供了上述的观蓝发酵培养基在观蓝发酵生产中的应用。

10、第三方面，本发明提供了一种利用上述的观蓝发酵培养基进行观蓝发酵生产的方法，包括如下步骤：

11、(1)活化基因工程菌in06得到种子液；

12、(2)配置基础发酵培养基，灭菌、冷却后，调节ph，添加诱导剂；再往基础发酵培养基中接种步骤(1)得到的种子液进行发酵；

13、(3)发酵过程中溶氧反弹至50％以上后，添加补料培养基进行补料；

14、(4)待观蓝产量不再增加时停止发酵，获得观蓝发酵培养液。

15、优选地，本发明采用基因工程菌in06进行观蓝的发酵培养；所述基因工程菌in06为专利cn 116064363b的基因工程菌。

16、优选地，所述步骤(1)中，所述活化的具体过程为：取出冷冻的含有基因工程菌in06的甘油菌液，待融化后取1ml接种于100ml lb培养基中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素在摇床中进行培养，培养条件为：35-37℃，225rpm，培养5-7h，培养至菌液的od600＞1.8即得到种子液。

17、所述lb培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph调节至7.0-7.2。

18、优选地，具体的发酵过程为：发酵全程控制温度在25℃左右，初始通气比为0.8vvm，初始转速200rpm，溶氧转速关联至35％；当转速达到900rpm后，取消溶氧转速关联，通过提高通气比(0.8-1.5vvm)控制溶氧处于30-40％左右。

19、优选地，所述发酵的过程于发酵罐中进行。

20、优选地，所述步骤(2)中，冷却温度至25℃。

21、优选地，所述步骤(2)中，ph调节至6.9-7.1。

22、发酵过程中ph的变化影响发酵产物的增长，ph在上述的范围内，生物量生长与产物增长相平衡，若ph高于7.1会影响菌株表达酶的酶活力，ph低于6.9则会造成菌株生长缓慢，不利于发酵产物的增长。

23、更优选地，所述步骤(2)中，ph调节至7.0。

24、优选地，所述步骤(2)中，采用氨水调节ph。

25、优选地，所述步骤(2)中，诱导剂为阿拉伯糖；所述诱导剂的添加量为0.5-1g/l。

26、添加阿拉伯糖为诱导剂，用于诱导蛋白表达。

27、优选地，所述步骤(2)中，发酵条件为：发酵温度24-26℃，转速200-900rpm。

28、优选地，所述步骤(3)中，发酵过程控制：通气比为0.8-1.5vvm，溶氧参数为30-40％，残糖的质量浓度小于5g/l。

29、发明人经大量实验发现，通过控制发酵过程中的通气比、溶氧参数在上述范围可促进菌株的生长，从而促进观蓝产量的提升。通气比用于维持溶氧，溶氧高于40％会出现富氧状态，合成大量过氧化物抑制菌株生长，低于30％则会处于缺氧状态，合成乙酸、乳酸等副产物。另一方面，葡萄糖与阿拉伯糖存在葡萄糖效应，葡萄糖过高时菌株无法吸收阿拉伯糖，造成诱导效果下降，本发明通过将残糖控制在5g/l以下防止残糖过高影响诱导效果。

30、优选地，所述步骤(3)中，补料的速率为3-4g/l/h。

31、优选地，当观蓝产量不再增加后停止补料，待ph反弹至7.5或溶氧反弹至70％后结束发酵。

32、本发明的有益效果为：

33、本发明针对当前观蓝发酵产量低、成本高、周期长的不足，提供了一种观蓝发酵培养基。本发明的观蓝发酵培养基的配方经优化后，组分简单，配置合理。相比于现有的培养基(lb培养基、zym培养基等)，本发明的观蓝发酵培养基采用廉价玉米浆干粉为氮源，降低了发酵成本，还大幅提高了观蓝的产量。

34、本发明还提供了利用本发明制备的观蓝发酵培养基进行观蓝发酵生产的方法，通过控制发酵条件，发酵罐发酵培养的观蓝产量高达54g/l，为目前业内最高水平，同时，将发酵周期缩短至60h以内，缩短了发酵周期，为观蓝产品的工业化生产奠定了基础。