针对猫FIPV的多表位抗原构建环状RNA疫苗的方法与流程

本发明涉及生物，具体地，涉及针对猫fipv的多表位抗原构建环状rna疫苗的方法，更具体地，涉及一种分离的核酸分子、表达载体、重组病毒、脂质体、疫苗、重组细胞、构建猫传染性腹膜炎病毒疫苗的方法及用途。

背景技术：

1、猫冠状病毒fcov属于冠状病毒。冠状病毒科病毒特征都是比较大、圆形、有囊膜的正链rna病毒，基因组在27～32kb之间，编码复制多聚酶、4种结构蛋白(s蛋白、m蛋白、n蛋白、e蛋白)与几种非结构蛋白。其中，s蛋白(spike protein)是冠状病毒的重要结构蛋白之一。它负责构成这些病毒的表面突起，并且也是这些病毒进行感染的关键因素之一。s蛋白可以结合宿主细胞上的受体，从而进入宿主细胞内部进行感染。除此之外，s蛋白还是许多冠状病毒疫苗的重要抗原。m蛋白(membrane protein)则参与了冠状病毒的颗粒形态的形成和定位。它是一种跨过病毒囊膜的蛋白，可以与其他蛋白相互作用以形成病毒粒子的结构。n蛋白(nucleocapsid protein)则包裹着病毒的rna基因组，并且参与到病毒基因复制和转录过程中。同时，n蛋白还能够诱导宿主免疫系统对病毒进行应答。e蛋白(envelopeprotein)则是冠状病毒囊膜上的蛋白，可以与m蛋白相互作用以形成病毒粒子的结构，同时还参与到病毒的感染和装配过程中。

2、根据新型冠状病毒的相关研究发现n蛋白的n端具有保守的与核酸结合的氨基酸位点，在冠状病毒中比较保守，且有多个t细胞或b细胞表位；冠状病毒的n蛋白的c端可以形成特殊的二级结构；而研究报道t细胞或b细胞表位集中的区域主要存在于nsp12非结构蛋白中；hr2_4与hr2_11两个b细胞表位来源于fipv的sii区域。

3、猫冠状病毒(fcov)根据生物型/致病力可分为：猫肠道冠状病毒(fecv)和猫传染性腹膜炎病毒(fipv)。fecv传播非常广泛，感染肠上皮细胞，几乎无症状或只有轻微腹泻。fipv主要感染猫单核细胞和巨噬细胞。从基因组序列很难区分fecv与fipv，虽然一些研究表明，fipv可以通过刺突蛋白氨基酸突变与fecv区分开来，但这些突变后来被发现与组织嗜性更相关。

4、fipv典型特征为各种组织和器官发生脓性肉芽肿性病变，包括肺、肝、脾、网膜和脑等。巨噬细胞和单核细胞的感染被认为是致病机制的关键。在fipv感染的终末期可观察到，外周和淋巴组织的t细胞大量减少，并经常出现高γ球蛋白血症，这表明存在严重的病毒诱导的免疫失调。体液免疫似乎不具有保护作用，可能导致“早期死亡综合征”。当s抗体以亚中和滴度存在时，可通过与fc受体结合增强靶细胞的感染。研究人员曾多次尝试开发fipv疫苗，但大多都失败了，失败主要原因是存在抗体依赖性的增强(ade)感染的现象，导致抗体无法发挥有效的保护作用。目前研究人员尝试通过细胞介导的免疫(cell-mediatedimmunity，cmi)来实现控制fipv的感染和清除，但仍未取得很好的保护效果。

5、因此，本领域亟需研发一种针对fipv的疫苗。

技术实现思路

1、本技术是发明人基于对以下问题和事实的发现而提出的：

2、针对目前fipv疫苗研发长期得不到新突破，导致fipv感染几乎都以猫的死亡而终结。

3、为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸分子。根据本发明的实施例，所述分离的核酸分子包括第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和第五核酸片段中的至少之一；其中，所述第一核酸片段来源于猫传染性腹膜炎病毒qs毒株的n蛋白的n端(ntd)；所述第二核酸片段来源于猫传染性腹膜炎病毒qs毒株的n蛋白的c端(ctd)；所述第三核酸片段编码猫传染性腹膜炎病毒qs毒株的nsp12蛋白；所述第四核酸片段来源于猫传染性腹膜炎病毒79-1146毒株s蛋白的表位hr2_4；所述第五核酸片段来源于猫传染性腹膜炎病毒79-1146毒株s蛋白的表位hr2_11；所述核酸分子为环状rna。根据本发明的实施例，表达猫传染性腹膜炎病毒的核酸分子可以刺激动物体细胞介导的免疫反应。

4、需要说明的是，在本技术中，也可根据需要对野生型fipv病毒的ntd、ctd、nsp12、hr2_4或hr2_11蛋白序列进行适应性改造，用以提高抗原表达，降低fipv病毒的毒性，同时不影响其三维结构，保留其免疫原性，制备新型的fipv病毒疫苗。根据序列比对结果(表1、2)，所述ntd蛋白具有与seq id no:1至少91％同源性的氨基酸序列，所述ntd蛋白核酸片段具有与seq id no:16～19至少71％同一性的核苷酸序列；所述ctd蛋白具有与seq id no:2至少92％同源性的氨基酸片段，所述ctd蛋白核酸片段具有与seq id no:20～23至少72％同一性的核苷酸序列；所述nsp12蛋白具有与seq id no:3至少97％同源性的氨基酸片段，所述nsp12蛋白核酸片段具有与seq id no:24～27至少71％同一性的核苷酸序列；所述hr2_4蛋白具有与seq id no:4至少50％同源性的氨基酸片段，所述hr2_4蛋白核酸片段具有与seq id no:28～31至少50％同一性的核苷酸序列；所述hr2_11蛋白具有与seq id no:5至少95％同源性的氨基酸片段，所述hr2_11蛋白核酸片段具有与seq id no:32～35至少73％同一性的核苷酸序列。fipv病毒疫苗不受特别限制，只要在生物体内能够产生改造后的fipv病毒ntd、ctd、nsp12、hr2_4和/或hr2_11蛋白的受体结合区，并且具有免疫原性，可以刺激生物体产生相应免疫反应即可。而且，所述分离的核酸分子可用于刺激能够感染猫传染性腹膜炎病毒的所有动物的免疫反应，包括但不仅限于猫。

5、需要说明的是，所述linker为两个融合蛋白间起连接作用的柔性或刚性氨基酸链，如3×flag、eaaak、gggs、aay、gpgpg、(ggggs)n等。在本技术中，实验中常用linker序列均可适用本技术实施例。

6、需要说明的是，在本技术中，所述ntd、ctd、nsp12、hr2_4和hr2_11通过linker相连，但相连方式并不受特别限制。示例性地，所述核酸分子的相连方式可以是ntd-linker-ctd-linker-nsp12-linker-hr2_4-linker-hr2_11，也可以是ntd-linker-nsp12-linker-ctd-linker-hr2_4-linker-hr2_11等。

7、表1：多亚株蛋白序列同源性(％)

8、

9、表2：多亚株核酸序列同一性(％)

10、

11、

12、注：-表示无。

13、根据本发明的实施例，上述分离的核酸分子还可以包括下列技术特征中的至少之一：

14、根据本发明的实施例，所述核酸片段相连或不相连。

15、根据本发明的实施例，所述核酸片段通过linker相连。在本技术的一些示例中，第一核酸片段～第五核酸片段通过linker相连作为一个核酸分子，能够刺激动物体细胞介导的免疫反应。

16、在本技术的一些示例中，所述核酸片段不相连。在本技术的一些示例中，上述第一核酸片段～第五核酸片段中任一核酸片段均能够刺激动物体细胞介导的免疫反应。示例性地，单独采用第一核酸片段对受试动物进行免疫，能够刺激动物体细胞介导的免疫反应。

17、在本技术的另一些示例中，上述第一核酸片段～第五核酸片段可进行自由组合刺激动物体细胞介导的免疫反应。示例性地，采用第一核酸片段和第二核酸片段相连对受试动物进行免疫，同样能够刺激动物体细胞介导的免疫反应。其中，组合方式可基于实际实验需求，进行设定，在本技术的一些示例中，任一组合方式均能实现刺激动物体细胞介导的免疫反应的效果。

18、根据本发明的实施例，所述核酸片段中的任意一个至少包括15个氨基酸。在本技术的一些示例中，发明人经过大量实验验证发现，在任一核酸片段截取15个氨基酸，即可实现刺激动物体细胞介导的免疫反应的效果。

19、在本技术的一些示例中，同样可对任一核酸片段中的15个氨基酸进行相连或不相连处理。经过实验验证，在相连或不相连的条件下，均能够实现刺激动物体细胞介导的免疫反应的效果。

20、根据本发明的实施例，所述ntd蛋白具有与seq id no:1至少91％同源性的氨基酸序列。

21、根据本发明的实施例，所述ntd蛋白具有seq id no:1所示的氨基酸序列。

22、根据本发明的实施例，所述ctd蛋白具有与seq id no:2至少92％同源性的氨基酸序列。

23、根据本发明的实施例，所述ctd蛋白具有seq id no:2所示的氨基酸序列。

24、根据本发明的实施例，所述nsp12蛋白具有与seq id no:3至少97％同源性的氨基酸序列。

25、根据本发明的实施例，所述nsp12蛋白具有seq id no:3所示的氨基酸序列。

26、根据本发明的实施例，所述hr2_4蛋白具有与seq id no:4至少50％同源性的氨基酸序列。

27、根据本发明的实施例，所述hr2_4蛋白具有seq id no:4所示的氨基酸序列。

28、根据本发明的实施例，所述hr2_11蛋白具有与seq id no:5至少95％同源性的氨基酸序列。

29、根据本发明的实施例，所述hr2_11蛋白具有seq id no:5所示的氨基酸序列。

30、根据本发明的实施例，所述第一核酸片段具有与seq id no:16～19任一序列至少71％同一性的核苷酸序列。

31、根据本发明的实施例，所述第一核酸片段具有seq id no:16～19所示的核苷酸序列。

32、根据本发明的实施例，所述第二核酸片段具有与seq id no:20～23任一序列至少72％同一性的核苷酸序列。

33、根据本发明的实施例，所述第二核酸片段具有seq id no:20～23所示的核苷酸序列。

34、根据本发明的实施例，所述第三核酸片段具有与seq id no:24～27任一序列至少71％同一性的核苷酸序列。

35、根据本发明的实施例，所述第三核酸片段具有seq id no:24～27所示的核苷酸序列。

36、根据本发明的实施例，所述第四核酸片段具有与seq id no:28～31任一序列至少50％同一性的核苷酸序列。

37、根据本发明的实施例，所述第四核酸片段具有seq id no:28～31所示的核苷酸序列。

38、根据本发明的实施例，所述第五核酸片段具有与seq id no:32～35任一序列至少73％同一性的核苷酸序列。

39、根据本发明的实施例，所述第五核酸片段具有seq id no:32～35所示的核苷酸序列。

40、需要说明的是，在本技术中，所述氨基酸序列的同源性是指两个氨基酸序列之间的相似度；所述核苷酸序列的同一性是指两个核苷酸序列之间的相似度。

41、根据本发明的实施例，所述核酸分子进一步包括第六核酸片段，所述第六核酸片段编码mhc-ⅰ(主要组织相容性复合体i)的信号肽序列(mhc-i sp)。根据本发明的实施例，在抗原序列的n端添加mhc-i信号肽的目的是使核糖体附着于内质网膜，指引蛋白在细胞内的运输。

42、根据本发明的实施例，所述mhc-ⅰ的信号肽序列不包含跨膜区。

43、根据本发明的实施例，所述mhc-ⅰ的信号肽序列具有如seq id no:6所示的氨基酸序列。

44、根据本发明的实施例，所述第六核酸片段具有seq id no:36～38所示的核苷酸序列。

45、根据本发明的实施例，所述第六核酸片段设置于所述核酸分子的5’端。

46、根据本发明的实施例，所述进一步包括第七核酸片段，所述第七核酸片段编码mitd(主要组织相容性复合体i类分子转运信号)序列。根据本发明的实施例，在所述核酸分子的c端添加mitd序列可刺激cd4+t细胞增殖，诱导产生更多的细胞因子。

47、根据本发明的实施例，所述mitd序列包含跨膜区。

48、根据本发明的实施例，所述mitd序列具有seq id no:7所示的氨基酸序列。

49、根据本发明的实施例，所述第七核酸片段具有seq id no:39～41所示的核苷酸序列。

50、根据本发明的实施例，所述第七核酸片段设置于所述核酸分子的3’端。

51、根据本发明的实施例，所述第八核酸片段编码hbha(结核分枝杆菌的肝素结合血凝素蛋白)佐剂序列。根据本发明的实施例，hbha具有较强的免疫刺激作用，可以诱导dc细胞的成熟，进而计划cd4+和cd8+t细胞，分泌ifn-γ，并诱导t细胞介导的细胞毒性。

52、根据本发明的实施例，所述hbha序列具有seq id no:8所示的氨基酸序列。

53、根据本发明的实施例，所述第八核酸片段具有seq id no:42～44所示的核苷酸序列。

54、根据本发明的实施例，所述第九核酸片段编码padre(pan hla-dr reactiveepitope)序列；根据本发明的实施例，padre属于“通用”的13个氨基酸的泛hla dr肽表位，用于激活cd4+t细胞。

55、根据本发明的实施例，所述padre序列具有seq id no:9所示的氨基酸序列。

56、根据本发明的实施例，所述第九核酸片段具有seq id no:45～47所示的核苷酸序列。

57、根据本发明的实施例，所述核酸分子进一步包括刚性或柔性的连接序列。

58、根据本发明的实施例，所述连接序列具有seq id no:11～15所示的氨基酸序列。

59、根据本发明的实施例，所述连接序列具有seq id no:51～70所示的核苷酸序列。

60、在本发明的第二方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带本发明第一方面所述的核酸分子。根据本发明的实施例，所述表达载体可以在细胞、细菌、酵母或猫科动物生物体内表达。

61、根据本发明的实施例，上述表达载体还包括下列技术特征的至少之一：

62、根据本发明的实施例，所述表达载体是非致病性病毒载体。

63、根据本发明的实施例，所述非致病性病毒选自反转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒中的至少之一。

64、在本发明的第三方面，本发明提出了一种重组病毒。根据本发明的实施例，所述重组病毒携带本发明第一方面所述的核酸分子。所述包含第一方面所述核酸分子的重组病毒可以稳定大量繁殖。

65、在本发明的第四方面，本发明提出了一种脂质体。根据本发明的实施例，所述脂质体包括脂质体载体以及核酸片段，所述核酸片段如本发明第一方面所限定的。所述含有脂质体载体以及核酸片段的脂质体在提高核酸稳定性、细胞摄取率、减少毒副作用、提高递送效率等方面具有重要作用。

66、在本发明的第五方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗包括本发明第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的表达载体、第三方面所述的重组病毒或第四方面所述的脂质体。根据本发明的实施例，采用前述疫苗可以高效激活动物细胞介导的免疫反应。此外，疫苗中仅包含能够激活细胞免疫反应的蛋白，避免产生毒副作用，具有更高的安全性。

67、根据本发明的实施例，上述疫苗还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

68、根据本发明的实施例，所述疫苗包括选自rna疫苗、dna疫苗、蛋白重组疫苗、灭活疫苗、减活疫苗、病毒载体疫苗的至少之一。

69、根据本发明的实施例，所述疫苗为rna疫苗。

70、根据本发明的实施例，所述疫苗进一步包括佐剂。

71、根据本发明的实施例，所述佐剂包括tlr激动剂、mn2+的至少之一。

72、根据本发明的实施例，所述tlr激动剂包括hbha、cpg，r837，mpla和其衍生物的至少之一。

73、在本发明的第六方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带本发明第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的表达载体或本发明第三方面所述的重组病毒。根据本发明的实施例，所述重组细胞用于包装携带所述核酸分子的病毒，以用于制备核酸疫苗，以刺激机体产生免疫反应。

74、在本发明的第七方面，本发明提出了一种构建猫传染性腹膜炎病毒疫苗的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括讲本发明第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的表达载体或第三方面所述的重组病毒导入受体细胞。根据本发明实施例的方法可包装携带所述核酸分子的病毒，以用于制备核酸疫苗。所述构建传染性腹膜炎病毒疫苗的方法安全、简便、高效。

75、根据本发明的实施例，上述方法还包括下列技术特征的至少之一：

76、根据本发明的实施例，所述导入受体细胞前，进一步包括使用包裹载体对所述核酸、表达载体或重组病毒进行包裹处理。根据本发明的实施例，使用包裹载体对所述核酸、表达载体或重组病毒进行包裹处理可以保护疫苗成分免受外界环境干扰影响其效价，而且包裹载体可以减少疫苗成分与外界环境的接触，从而减少疫苗成分受到污染的风险，提高疫苗的安全性。此外，部分包裹载体还具有增强疫苗成分的感染力的作用，从而使其能够更有效地激发免疫反应。

77、根据本发明的实施例，所述包裹载体选自脂质体、聚合物载体、病毒载体、纳米颗粒中的至少之一。

78、根据本发明的具体实施例，所述包括载体为纳米颗粒。

79、根据本发明的实施例，所述受体细胞为crfk细胞、hek293ft、hek293t或bhk细胞。

80、根据本发明的实施例，所述受体细胞为crfk细胞。

81、在本发明的在本发明的第八方面，本发明提出了一种本发明第一方面所述核酸分子、第二方面所述表达载体、第三方面所述重组病毒、第四方面所述脂质体或第六方面所述重组细胞在制备药物或疫苗中的用途。根据本发明的实施例，所述药物或疫苗用于预防或治疗猫传染性腹膜炎病毒感染相关疾病。根据本发明的实施例，基于前述核酸分子、表达载体、重组病毒或重组细胞制备的药物或疫苗具有高安全性，可短时间内激活动物细胞介导的免疫反应。

82、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。