罗布麻叶多糖及其制备方法和应用

本发明属于中药活性提取物制备领域，涉及罗布麻叶多糖及其制备方法和应用，具体涉及到两种新的罗布麻叶多糖的提取与纯化，及其在防治心血管疾病方面的应用。

背景技术：

1、心血管疾病(cvd)是严重危害我国人民群众健康和生命的重大疾病。2023年11月15日，国家卫生健康委牵头制定的《健康中国行动-心脑血管疾病防治行动实施方案(2023—2030年)》明确指出，要“实施危险因素控制，降低发病和死亡风险”，“强化关口前移，创新心脑血管疾病同防同治路径”。《中国心血管健康与疾病报告2022》数据显示，在我国城乡居民疾病死亡构成比中，cvd占首位。目前我国心力衰竭患者的主要病因是高血压和冠心病。因此，寻找疗效确切、副作用小的防治心力衰竭的药物，对提高患者生活质量至关重要。

2、罗布麻叶(apocynum venetum l.)是临床治疗高血压的特色中药之一，自1977年开始被《中国药典》收录，2020版《中国药典》记载，罗布麻叶甘、苦，凉，归肝经，具有“平肝安神，清热利水”之功效，中医临床主要用于治疗肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿尿少，即现代医学用语中的高血压病。当前，罗布麻叶制剂以单用为主，现已批准的55个中成药等品种的适应症也以高血压病居多。

3、罗布麻叶的主要活性成分为黄酮类小分子化合物，《中国药典》规定的罗布麻叶的指标成分金丝桃苷即为一种黄酮苷，具有较广泛的心血管相关活性报道。然而，当前罗布麻叶多糖类成分的研究不足，文献已报道的罗布麻叶多糖非常少。

4、青岛大学周金辉在其硕士毕业论文“罗布麻叶多糖提取及其生物活性的研究”中，采用酸(hcl)、碱(naoh)和蒸馏水提取罗布麻叶多糖，研究了不同提取溶剂和提取温度对罗布麻叶多糖产率的影响；此外，还发现碱提取的罗布麻叶多糖的抗氧化能力和酶抑制活性最强。经小鼠活体实验发现罗布麻叶多糖对于治疗ii型糖尿病，改善胰岛β细胞功能发挥着重要的作用；血脂谱的分析结果表明，罗布麻叶多糖对于改善血脂水平很有效果。东北师范大学魏柠柠在其硕士论文“罗布麻叶多糖的分离纯化、结构分析以及与半乳凝集素的相互作用”中，采用干燥的罗布麻叶经过热水煮提、乙醇沉淀和sevag法脱蛋白得到罗布麻叶水溶性粗多糖alp(5.8％)。alp经过柱层析得到一个中性糖级分alpn和两个酸性糖级分alpa-1和alpa-2，alpa-1和alpa-2进一步得到两个较均一的多糖组分alpa-1a和alpa-2a。在血细胞凝集阻抑实验中，alpa-1b和alpa-2a表现出明显的抑制血细胞凝集的活性。

5、中国专利cn109288856a提供了罗布麻叶多糖在制备降血糖和/或降血脂药物中的应用。cn112516014a公开了一种罗布麻提取物，有效成分包括罗布麻精油和罗布麻多糖，其中罗布麻多糖除了常见的锁水保湿功效外，还具有优良的抗氧化与抗紫外辐射作用，能够保护皮肤，隔绝外界的刺激、炎症及紫外线污染。cn112353733a公开了一种罗布麻发酵产物的发酵方法及其在抗炎化妆品中的应用，其提供的发酵方法使发酵液中有效成分罗布麻多糖含量高达0.56％，罗布麻发酵产物具有良好的体内抗炎活性。cn112494360a公开了一种罗布麻多糖提取物的提取方法、罗布麻多糖提取物及应用，其罗布麻多糖提取物具有良好的体内美白活性。cn109517087a公开了一种罗布麻叶多糖的制备方法，包括将罗布麻叶与提取液混合进行提取，得到提取物等步骤，以提高罗布麻叶多糖的产率，但是并没有涉及到罗布麻叶多糖的应用。

6、现有研究中，大多是针对罗布麻叶多糖等提取物的制备工艺的优化，其功效研究较少，在目前的功效研究中，又以罗布麻叶多糖的抗氧化、降血压、抗抑郁的活性研究居多，未见罗布麻叶多糖在防治心血管疾病方面的研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了罗布麻叶多糖及其制备方法和应用，从中药罗布麻叶的提取物中发现了两个新的多糖，属于新化学成分，并通过实验发现这两个多糖具有抗心力衰竭活性。

2、本发明的技术方案是：

3、本发明提供了一种罗布麻叶多糖av1-n1，所述多糖av1-n1的重均分子量为64.1kda，多分散指数为2.317；其单糖组成为岩藻糖fuc、鼠李糖ara、半乳糖gal、葡萄糖glc、木糖xyl、甘露糖man、核糖rib和甘露糖醛酸glc-ua，所述岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、甘露糖醛酸的摩尔百分比分别为0.13％、40.23％、50.00％、2.05％、1.58％、1.41％、0.80％和3.80％。

4、进一步的，所述多糖av1-n1具有如下结构单元：

5、

6、本发明还提供了一种罗布麻叶多糖av2-n1，所述多糖av2-n1的重均分子量为58.8kda，多分散指数为1.753；其单糖组成为岩藻糖fuc、鼠李糖ara、半乳糖gal、葡萄糖glc、木糖xyl、甘露糖man、半乳糖醛酸gal-ua和甘露糖醛酸glc-ua，所述岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸的摩尔百分比分别为：0.95％、50.04％、37.31％、0.95％、1.09％、0.68％、3.56％和5.42％。

7、进一步的，所述多糖av2-n1具有如下结构单元：

8、

9、进一步的，上述罗布麻叶多糖av1-n1和/或罗布麻叶多糖av2-n1的制备方法，包括以下步骤：

10、(1)取烘干后的罗布麻叶粉碎过筛，加入无水乙醇常温超声提取，合并提取液，离心收集沉淀，向沉淀中加入适量纯水，60℃超声提取，再次合并提取液，离心，收集上清提取液，45℃减压浓缩提取液至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇4℃环境下过夜醇沉，离心收集固体沉淀，即得到多糖粗提物；

11、(2)向多糖粗提物中加入适量纯水和木瓜蛋白酶，过夜酶解；然后加入适量三氯甲烷和正丁醇，充分搅拌混匀，收集上层水相；再加入适量石油醚，充分搅拌混匀，收集下层水相；最后，向水相中加入适量ab-8型大孔吸附树脂，充分混匀后，静置过夜；收集滤液，透析、冷冻干燥，得到罗布麻叶粗多糖；

12、(3)取适量粗多糖溶解于纯水中，配成浓度10mg/ml的多糖母液，离心取上清液，采用离子交换柱进行洗脱，收集洗脱液，经减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到数个粗多糖组分；

13、(4)取离子柱纯化后的1个粗多糖加纯水，配成浓度15mg/ml的多糖母液，离心取上清液，采用凝胶柱层析柱进行洗脱，收集洗脱液，经减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到多糖av1-n1；采用同样操作，对离子柱纯化后的另一粗多糖组分进行凝胶柱层析，得到多糖av2-n1。

14、进一步的，所述步骤(3)中采用deae seplife ff型阴离子交换柱，规格为26mm×400mm，依次采用纯水、0.1mol/l、0.2mol/l和0.3mol/l氯化钠溶液等梯度洗脱，流速4ml/min；所述步骤(4)中采用sephacryl s-400hr型凝胶柱层析柱，规格为26mm×1000mm，采用纯水洗脱1.5倍柱体积，流速1ml/min。

15、本发明还提供了上述罗布麻叶多糖av1-n1和/或罗布麻叶多糖av2-n1在制备改善或治疗心力衰竭的药物中的应用。

16、本发明还提供了上述罗布麻叶多糖av1-n1和/或罗布麻叶多糖av2-n1在制备改善心力衰竭的食品、保健品中的应用。

17、本发明又提供了一种改善或治疗心力衰竭的药品，所述药品含有上述罗布麻叶多糖av1-n1和/或罗布麻叶多糖av2-n1。

18、斑马鱼模型在筛选心脏保护活性成分方面具有独特优势，斑马鱼心脏在结构、功能、信号通路和离子通道方面与人类心脏高度相似，血脂组成、代谢与人类的基本一致，且胚胎及其幼体近乎透明，心血管可视，可活体观察心跳、血管形成和血管病变。基于此，本发明制备两种罗布麻叶多糖，并评价了罗布麻叶多糖在改善阿霉素引起的心力衰竭的作用功效，为其临床应用提供科学依据。

19、本发明的有益效果：

20、本发明从中药罗布麻叶的提取物中进一步纯化得到2个新的罗布麻叶多糖av1-n1和av2-n1，通过纯度及分子量测定、单糖组成测试分别得到这两个多糖的分子量及单糖组成，其中多糖av1-n1和av2-n1的数均分子量分别为27.7和33.6kda，峰值分子量分别为29.9和55.3kda，重均分子量分别为64.1和58.8kda，z均分子量分别为590.8和164.1kda，多分散指数分别为2.317和1.753；多糖av1-n1的单糖组成为岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、甘露糖醛酸；av2-n1的单糖组成为岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和甘露糖醛酸；通过单糖甲基化测试、多糖核磁检测分别得到这两种多糖的糖苷键的类型和连接顺序，以及主链与支链的连接位点等结构信息，得到多糖的结构单元。本发明基于斑马鱼模型，对上述两种多糖在改善或治疗阿霉素引起的心力衰竭方面的功效进行实验，发现这两个多糖具有抗心力衰竭活性。