用于检测犬细小病毒的LAMP冻干试剂、应用及检测方法与流程

本发明涉及一种用于检测犬细小病毒的lamp冻干试剂、应用及检测方法。

背景技术：

1、犬细小病毒病是由犬细小病毒（canine parvovirμs，cpv）引起的犬的一种急性传染病，临床上以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征。犬细小病毒是家养狗和猫以及各种野生生物种的潜在致命病原体，此病毒发病特征为食肉动物产生呕吐、发烧、白细胞减少和腹泻，且多发于3～6月幼龄犬，感染率可高达100%，致死率为10%～50%。该病的流行无明显季节性，cpv会随粪便、尿液、呕吐物及唾液排出体外，且在康复犬的粪便中可长期带毒。故早期和快速诊断对预防cpv传播和疾病管理至关重要，在目前现有的诊断方法中，病毒分离、血凝抑制、电镜检查、elisa等方法操作步骤繁琐，且检测周期较长，不利于实现快速诊断；胶体金检测方法尽管可以实现快速检测，但是往往需要通过更为灵敏和准确的分子生物学方法进行确诊；而分子生物学方法中，pcr和实时荧光pcr需要特定的扩增仪器，不便于实现现场检疫。

2、环介导等温核酸扩增技术(lamp)是由 notomi于2000 年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法,该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,借助具有链置换作用bst酶的帮助从而可在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。

3、近年来，基于lamp的检测方法已被广泛应用，包括疟疾和沙门氏菌等病原体的检测，用逆转录酶lamp (rt-lamp)快速检测hiv病毒rna，转基因作物污染，以及在法医科学中专门检测人类dna。hong tc 等人（2004） 根据 lamp的原理设计了实时定量rt-lamp方法,以快速检测sars-cov,结果rt-lamp的灵敏度是rt-pcr的100倍;潘珺等人(2020)建立了犬细小病毒可视化 lamp检测方法，结果显示63℃恒温扩增60min具有良好的敏感性和特体系，最低检测到10copies/μl。王林等人发表检测犬细小病毒的lamp引物组、荧光可视化快速试剂盒及方法，表明63℃恒温扩增60min检测最低为10copies。

4、但是上述检测cpv病毒核酸时长较长，且基本采用染料法容易引起假阳，特异性不高。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于检测犬细小病毒的lamp冻干试剂、应用及检测方法，可以有效解决上述问题。

2、本发明是这样实现的：

3、本发明提供一种用于检测犬细小病毒的环介导恒温扩增冻干试剂，包括：

4、缓冲剂、冻干缓冲剂、引物组以及酶；其中，所述引物组包括以下引物：

5、f31：5’-tcttttgaggcgtctacac-3’；

6、b31：5’-ttgaatccaatctccttctg-3’；

7、fip1：5’-attttcatctgtttgcgctcc aagggccatttaaaacaccta-3’；

8、bip1：5’- caagatatgcatttggtagacaacatgctatatatgtaaatctctcaggtg -3’；

9、lb1：5’-gtcaaaaaactaccacaacaggag-3’；

10、p1：fam-5’-cccgtcctgctgcaa-3’-bhq1；其中，fam为修饰的荧光报告基团、bhq1为修饰的淬灭基团。

11、作为进一步改进的，所述缓冲剂包括：tris-hcl缓冲液、kcl、mgso4、dntps以及甜菜碱。

12、作为进一步改进的，所述酶包括内切酶以及bst聚合酶。

13、作为进一步改进的，所述冻干缓冲剂包括：pvp k30、海藻糖、甘露醇、葡聚糖2w以及ficol400。

14、本发明进一步提供一种上述的冻干试剂在检测犬细小病毒中的应用。

15、本发明进一步提供一种用于检测犬细小病毒的方法，包括以下步骤：

16、使用上述的冻干试剂融化后加入待测样品，并通过环介导等温扩增-光谱传感器对待测样品进行检测的步骤。

17、作为进一步改进的，所述通过环介导等温扩增的步骤：在63℃条件下进行lamp扩增，25-35min后扩增结束。

18、本发明的有益效果是：本发明使用荧光环介导恒温扩增技术来检测犬细小病毒，lamp反应是由发夹状lamp引物侵入dna模板引发的，该引物在dna聚合酶链置换的催化下退火和延伸。这些退火的lamp引物在扩增起始时依次被置换引物取代，并导致哑铃状结构的形成。这种结构形成了循环扩增和延伸的基础，仅用lamp引物就可以形成菜花状的单链dna环。lamp引物fip和bip(正向和反向内引物)用于杂交f2/b2和f1/b1的互补和反向互补目标序列。置换引物称为f3和b3。loop引物的加入分别从发夹环或环间区域杂交和延伸，从而加速扩增，可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增。本发明还在此基础上设计探针，当探针没有与环引物结合时,由于探针的性质原因,荧光基团与淬灭基团之间距离很近,荧光基团被淬灭而不能直接发出荧光信号;当要与目的片段进行结合时,探针在内切酶作用下被切割,荧光基团被激活后产生发射信号进而被系统检测到。

19、本发明还具有检测快速等特点：本发明扩增仅需30min就可完成，相对比常规qpcr反应需要1~2h才能完成检测，大大缩短检测时间，且当病原体检测浓度高时，扩增在10min内可出峰。

20、本发明还具有特异性高等特点：由于lamp需要至少6对及以上的引物，且引物较长，容易产生引物二聚体，导致引物非特异性扩增。由于探针的特异性，且只有当探针与模板结合后，才能被水解产生荧光，所以lamp探针法相较于传统的lamp染料法和比色法，更有效的减少了非特异性扩增的干扰。进一步的，lamp探针法，可以通过对不同病原体的特异探针标记不同的荧光基团，实现单管多重的检测。这是传统的lamp染料法和比色法无法实现的。最好，本发明为冻干试剂，使用时无需配制，只需融化，运输成本低且保存成本低。

技术特征：

1.一种用于检测犬细小病毒的环介导恒温扩增冻干试剂，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的用于检测犬细小病毒的环介导恒温扩增冻干试剂，其特征在于，所述缓冲剂包括：tris-hcl缓冲液、kcl、mgso4、dntps以及甜菜碱。

3.如权利要求1所述的用于检测犬细小病毒的环介导恒温扩增冻干试剂，其特征在于，所述酶包括内切酶以及bst聚合酶。

4.如权利要求1所述的用于检测犬细小病毒的环介导恒温扩增冻干试剂，其特征在于，所述冻干缓冲剂包括：pvp k30、海藻糖、甘露醇、葡聚糖2w以及ficol400。

5.根据权利要求1-4任一项所述的冻干试剂在检测犬细小病毒中的应用。

6.一种用于检测犬细小病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的用于检测犬细小病毒的方法，其特征在于，所述通过环介导等温扩增的步骤：在63℃条件下进行lamp扩增，25-35min后扩增结束。

技术总结本发明提供了一种用于检测犬细小病毒的LAMP冻干试剂、应用及检测方法。所述冻干试剂包括：缓冲剂、冻干缓冲剂、引物组以及酶；其中，所述引物组包括以下引物：F31：5’‑TCTTTTGAGGCGTCTACAC‑3’；B31：5’‑TTGAATCCAATCTCCTTCTG‑3’；FIP1：5’‑ATTTTCATCTGTTTGCGCTCC AAGGGCCATTTAAAACACCTA‑3’；BIP1：5’‑CAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGCTATATATGTAAATCTCTCAGGTG‑3’；LB1：5’‑GTCAAAAAACTACCACAACAGGAG‑3’；P1：FAM‑5’‑CCCGTCCTGCTGCAA‑3’‑BHQ1；其中，FAM为修饰的荧光报告基团、BHQ1为修饰的淬灭基团。技术研发人员：江贤华,何燕华,段雪昆,王露,洪阅滨,彭成彬,田如敏受保护的技术使用者：厦门宝太生物科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18