一种可用于实时监测体内/外乙酰胆碱酯酶的小分子生物发光探针及制法和应用

本发明属于乙酰胆碱酯酶活性检测，尤其涉及一种可用于实时监测体内/外乙酰胆碱酯酶的小分子生物发光探针及制法和应用。

背景技术：

1、乙酰胆碱酯酶(ache)作为一种神经递质水解酶，其在多种正常生理功能的调节中起着至关重要的作用。研究表明，ache的表达异常与多种疾病的发生与发展息息相关，例如：ache含量异常的现象被公认为阿尔茨海默病和帕金森病等神经系统疾病的关键因素之一；此外，ache还与多种肿瘤的发生、增殖、迁移以及凋亡有着密切的关系。因此，ache作为一种重要的生物标记物在众多疾病的早期诊断和病理学研究中有着及其重要的价值。最新研究发现，肿瘤细胞在药物或其他外界因素刺激作用下的凋亡过程会伴随有ache异常上调的现象发生。通过特异性检测肿瘤细胞凋亡过程中ache的含量变化，有望实现快速的病理筛查以及对某些抗肿瘤药物进行简单、直观的药效学评估。因此，开发一种可以用于体内和体外ache含量波动的精准检测试剂在新药开发、药效学评估以及病理学研究等领域有着巨大的应用前景。

2、目前被报道可用于ache含量检测的方法有比色法、电化学法和荧光法，其中比色法和电化学法不能用于动物活体水平成像，进而无法实时追踪动物(实验小鼠)体内内源性ache在各种生理和病理条件下的功能性变化。荧光法作为一种高效的光学成像手段，因其高灵敏性、高时空分辨率和非侵袭性等优点被广泛用于ache酶的体外样本的检测(如血液样本和病理组织样本)以及动物(实验小鼠)水平可视化成像检测。基于此，多种ache响应型荧光探针被相继开发，例如：2019年，tang等报道了一种双光子荧光探针mcyn并将其成功用于小鼠的脑部ache实时监测(j.am.chem.soc.,2019,141(5):2061-2068.)。此外，2022年，liu等报道了一种具有较强组织穿透深度的近红外荧光探针nfl-sf，用于实时追踪小鼠内体ache的实时波动(sens.actuators,b,2022,360:131647.)。尽管现有的荧光探针技术可用于体外/内的ache的成像检测，然而，荧光法在检测时往往因外界激发光源的诱导，不可避免的产生生物组织自发光、光漂白、光散射以及光毒性等副作用，其在检测结果准确性和生物安全性上存在显著的缺陷。

3、生物发光作为一种自然界中生物体内(萤火虫)的自发光形式，其在生物安全性上十分可靠；其次，生物发光无需外界光源激发可自发产生强烈的光学信号，进而可有效避免上述荧光探针成像时的缺陷，其在生物活体检测中表现出高灵敏度、高稳定性、高生物安全性以及高信噪比(s/n)等显著的成像优势。然而，目前国内外尚无可用于体内/外ache实时成像的生物发光探针被报道。

技术实现思路

1、发明目的：为了克服现有ache检测技术的不足，尤其ache响应型荧光探针在检测结果准确性和生物安全性上的缺陷，本发明基于生物发光成像的特点，提供了系列可用于实时监测体内/外ache的小分子生物发光探针(ahbl-1，ahbl-2，ahbl-3)，并通过系统的体内/外成像实验优选出最优结构的ache响应型生物发光探针ahbl-3，此外，还提供了上述生物发光探针的制备方法和应用。

2、技术方案：本发明可用于实时监测体内/外乙酰胆碱酯酶的小分子生物发光探针，该生物发光探针记为ahbl-1，其化学结构如下式(i)所示：

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4、本发明可用于实时监测体内/外乙酰胆碱酯酶的小分子生物发光探针，该生物发光探针记为ahbl-2，其化学结构如下式(ii)所示：

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6、本发明可用于实时监测体内/外乙酰胆碱酯酶的小分子生物发光探针，该生物发光探针记为ahbl-3，其化学结构如下式(iii)所示：

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8、本发明的系列小分子生物发光探针的发光成像机制(即探针点亮机制)流程如下所示：

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10、本发明的系列探针ahbl-1，ahbl-2，ahbl-3由于发光团d-luc(iv)连接有淬灭基团，因此本身无任何光学信号。当其在ache特异性催化作用下可选择性脱除系列探针分子结构中的淬灭基团，进而分别生成对应的化合物ix-1，ix-2，ix-3。而该系列化合物(ix-1，2，3)均极不稳定，可经分子内电子转移自发生成d-luc(iv)，生成的d-luc在荧光素酶(firefly luciferase,fluc)的作用下可迅速分解为化合物xi并伴随有强烈的光学信号产生。

11、本发明制备小分子生物发光探针ahbl-1的路线如下所示：

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13、制备方法包括如下步骤：摩尔比为1:(1～4):(1～5)将化合物(iv)和化合物(v)在缚酸剂的作用下，于有机溶剂、0-150℃条件下反应1-12h制得式(i)所示的生物发光探针。

14、本发明制备小分子生物发光探针ahbl-2的路线如下所示：

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16、制备方法包括如下步骤：按摩尔比为1:(1～3):(1～3.5)将化合物(iv)和化合物(vi)在缚酸剂作用下，于有机溶剂、0-120℃条件下反应1-12h制得式(ii)所示的生物发光探针。

17、本发明制备小分子生物发光探针ahbl-3的路线如下所示：

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19、制备方法包括如下步骤：摩尔比为1:(1～2.5):(1～3)将化合物(iv)和化合物(vii)在缚酸剂作用下，于有机溶剂、0-80℃条件下反应1-6h制得式(iii)所示的生物发光探针。

20、进一步说，本发明制备ahbl-1、ahbl-2、ahbl-3时，所采用的缚酸剂可为碳酸氢钾、碳酸氢钠、无水碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钾、无水碳酸钠、三乙胺、吡啶、n,n-二异丙基乙胺、氢氧化钠、哌嗪、咪唑、哌啶、dbu、氢化钠、氢氧化钠或氢氧化锂。

21、进一步说，本发明制备ahbl-1时所采用的有机溶剂可为n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷或二甲基亚砜。

22、进一步说，本发明制备ahbl-2时所采用的有机溶剂可为甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚、环氧丙烷、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯仿或乙酸乙酯。

23、进一步说，本发明制备ahbl-3时所采用的有机溶剂为四氢呋喃、甲醇、异丙醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯仿、乙醚或甲基叔丁醚。

24、小分子生物发光探针在制备乙酰胆碱酯酶生物发光检测试剂或检测元件中的应用。优选的，检测元件可为试纸条或试剂盒。

25、有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为，该系列生物发光探针(ahbl-1，ahbl-2，ahbl-3)均仅通过一步烷基化反应即可获得，制备过程简单，易于推广。

26、相对于现有的比色法和电化学法检测ache手段而言，本发明的生物发光探针不仅可用于体外对ache活性的监测，同还能够用于活体内进行实时监测，提高了适用性。而相比于现有的荧光法检测ache，本发明探针不会产生生物组织自发光和光漂白的现象，进而有较高的灵敏度和信噪比，检测结果更具加准确，且不会产生光毒性，因而在活体成像时具有更好的使用安全性；此外，不会因光热效应导致正常组织的灼伤，从而在活体成像时具有更好的适用性。即，该系列生物发光探针能够在动物活体水平条件下，高灵敏度、高选择性、高稳定性、高生物安全性以及高信噪比(s/n)地体内/外实时监测ache含量波动。

27、该生物发光探针具有较高的分子结构稳定性，目前已经成功实现其在顺铂等抗癌药物诱导动物活体肿瘤凋亡作用中的药效学评估的作用，这一理想的体内成像效果预示本发明的生物发光探针在ache相关的新药开发、药效学评估以及病理学研究等领域有着巨大的应用潜力。