一种用于流产衣原体检测的LMTIA引物组及应用

本发明属于分子生物学，尤其涉及用于检测的引物组，具体是一种用于流产衣原体检测的lmtia引物组、探针、试剂盒及应用。

背景技术：

1、流产衣原体(chlamydophila abortus)属衣原体科衣原体属，是一种重要的人兽共患革兰氏阴性致病菌，可感染人并引起孕妇流产，被认为是绵羊地方性流产(ovineenzootic abortion，oea)的主要病原。流产衣原体主要感染反刍动物(特别是牛、绵羊和山羊)，并可在畜群中流行，导致被感染动物在妊娠后期出现流产、死胎和产弱仔等现象，对畜牧业造成严重的经济损失，人群也会通过接触患病动物及流产胎儿或吸入阳性气溶胶感染，参与到传染链条中。由于患病动物在感染早期很少表现出典型的临床症状，因此在怀孕期间及早发现病原的感染对于控制该病的传播至关重要，加强对流产衣原体检测方法的研究具有重要的实际意义和应用价值。

2、目前，关于流产衣原体的检测方法主要有病原检测法、血清学检测法和核酸检测法。根据世界动物卫生组织(office international desépizooties，oie)陆生动物疾病诊断手册，可采用改良的zilhl-neelsen(zn)方法对流产衣原体进行直接鉴定，但该方法依赖于熟练的技术人员，且存在一定的误检可能。补体结合试验(complement fixation test，cft)一直是诊断oea的标准血清学方法，但由于其特异性较低，逐渐被酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay，elisa)所替代。目前，市场上流产衣原体的elisa检测试剂盒主要基于三种抗原：主要外膜蛋白(momp)、多态外膜蛋白(pomp)和脂多糖(lps)，然而，基于不同抗原的elisa检测试剂盒在特异性和敏感性上还存在较大差异。基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)技术建立的核酸检测方法，如pcr、real-time pcr、dnamicroarray和核酸等温扩增技术(lamp、rpa)等，由于其高特异性和灵敏度而被广泛应用于流产衣原体的检测盒诊断中。

3、cn110760601a公开了一种基于多重pcr办法，可以同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌，cn110656290a公开了一种可以同时检测流产布鲁氏菌、分歧杆菌和流产衣原体的多重pcr引物组，cn110791579a公开了一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量pcr检测试剂盒和检测方法，以上核酸检测方法所需检测时间较长，往往需要等待一个小时以上，且灵敏度有待进一步提高。

4、梯形熔解温度核酸等温扩增技术(ladder-shape melting temperatureisothermal amplification，lmtia)是一种新型基因快速精准检测技术，可以在等温环境下对靶基因进行高效、快速的扩增，大大缩短反应时间(小于30min)，并可与特异性荧光探针结合，进一步提高扩增反应的灵敏度和特异性。目前，尚未有报道利用lmtia技术结合特异性荧光探针检测流产衣原体的试剂盒的检测方法。

5、因此，基于lmtia技术建立一种实验室诊断和临床检测流产衣原体的快速检测方法，对该病流行传播的控制和预防具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明提出了一种用于流产衣原体检测的lmtia引物组、探针、试剂盒及其应用，能够有效的解决现有技术中对流产衣原体存在漏诊、检测所需时间较长等问题，为流产衣原体实验室诊断和临床快速检测中提供技术支持。

2、本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：

3、一种用于流产衣原体检测的lmtia引物组，与探针相配合，引物组和探针的序列如下：

4、c.abortus-f：

5、5’-ttcggggagtttggatatgtttttagcaatagagtttccaaatcag-3’

6、c.abortus-b：

7、5’-actccccgaagacaaacattttctatccttgagttatttgtga-3’

8、c.abortus-lf：5’-ggagagagtaacagccttgga-3’

9、c.abortus-lb：5’-gtgagtagattgtcaaaaacga-3’

10、c.abortus-lf pr：5’-bhq2-agagtaacagcctta-6-fam-3’。

11、一种用于流产衣原体检测的试剂盒，包括上述lmtia引物组和探针。

12、在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

13、进一步的，所述阳性对照品为流产衣原体基因组dna，阴性对照品为无菌双蒸水。

14、上述lmtia引物组、探针、试剂盒应用于流产衣原体c.abortus检测中。

15、一种检测流产衣原体的方法，利用上述的用于检测流产衣原体的lmtia引物组和探针或试剂盒进行核酸等温扩增。

16、在本发明中，检测方法包括以下步骤：

17、(1)取待测样品，抽提样品基因组dna；

18、(2)利用上述样品基因组dna，用前述lmtia引物组、探针或试剂盒配置lmtia反应体系，并将配制好的lmtia反应体系置于实时荧光pcr仪中进行等温扩增；

19、(3)对扩增曲线进行分析，若结果图中出现指数曲线，则该样品为流产衣原体阳性，若无扩增曲线，则该样品为流产衣原体阴性。

20、进一步的，所述检测方法步骤(2)中等温扩增的温度为59.5℃，等温扩增的时间为30min。

21、本发明提供上述用于检测流产衣原体的lmtia引物组、探针的用途，可用于检测流产衣原体。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明所述的用于检测流产衣原体的lmtia引物组、探针具有良好的特异性和灵敏度，特异性好，于59.5℃时特异性更好，灵敏度高，可达10fg/μl，检测速度快，仅需不到30分钟，在恒温条件下即可实现对样品中流产衣原体的检测。

技术特征：

1.一种用于流产衣原体检测的lmtia引物组，与探针相配合，其特征在于：所述引物组和探针的序列如下：

2.一种用于流产衣原体检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1中所述的lmtia引物组和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照品和阴性对照品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为流产衣原体基因组dna，阴性对照品为无菌双蒸水。

5.权利要求1所述的lmtia引物组、探针在流产衣原体c.abortus检测中的应用。

6.权利要求2-4任一所述的试剂盒在流产衣原体c.abortus检测中的应用。

7.一种检测流产衣原体的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的lmtia引物组、探针或权利要求2-4任一所述的试剂盒进行核酸等温扩增。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中等温扩增的温度为59.5℃，等温扩增的时间为30min。

技术总结一种用于流产衣原体检测的LMTIA引物组及应用，属于分子生物学技术领域，其中引物组及相配合的探针的序列包括Cab‑F、Cab‑B、Cab‑LF、Cab‑LB、Cab‑LF Pr，通过LMTIA反应体系扩增后能够快速有效的检测流产衣原体，特异性好，灵敏度高，检测速度快。技术研发人员：崔朝辉,王德国,黄夕瑶,张良,卢作焜,贾凯,周世杰,贾璇,冯晓轩,张素兰,田娟受保护的技术使用者：许昌学院技术研发日：技术公布日：2024/6/18