通过数字PCR方法检测RET融合基因的方法及其试剂盒与流程

本发明涉及数字pcr检测领域，特别涉及通过数字pcr方法检测ret融合基因的方法及其试剂盒。

背景技术：

1、ret基因的融合事件已经被广泛报道，这些融合基因产生的融合蛋白具有异常的激酶活性，是一些肿瘤的重要驱动因素。

2、已有文献报道方法(liu y等,thoracic cancer,2020)，通过数字pcr检测ret基因3端及5端表达不平衡，在甲状腺癌中进行ret融合基因的检测，在该方法中，使用3端/内参基因(ic)和3端/5端作为检测参数，可能存在无法判读的风险，由于ret基因在甲状腺组织中表达量较低，甚至可能不表达，此时3端/5端的比值无法计算，则无法对样本是否ret融合基因阳性进行判断。因此，寻求一种更为快速、准确、可靠的检测方法具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提出了一种联合使用tkd/ic、no/ic及tkd/no作为检测参数的方法(其中tkd代表酪氨酸激酶区，no代表非酪氨酸激酶区，ic代表内参基因)，以克服上述无法判读的风险，准确检测ret融合基因。

2、在一种实施方式中，本发明提供一种通过数字pcr方法检测ret融合基因的方法，所述方法包括：

3、步骤1：通过收集满足统计分析要求数量的ret融合基因阴性和阳性的组织样本，检测每个阴性和阳性的组织样本的tkd区、no区的rna表达量，计算tkd区的rna表达量/内参基因的rna表达量的比值tkd/ic、no区的rna表达量/内参基因的rna表达量的比值no/ic和tkd区的rna表达量/no的rna表达量的比值tkd/no；并分别确定tkd/ic阈值、no/ic阈值和tkd/no阈值，所述内参基因的rna拷贝数与ret融合阳性的tkd区的rna拷贝数比值为0.01倍到100倍；

4、步骤2，通过数字pcr方法检测待测样本的ret基因tkd区的rna拷贝数，通过数字pcr方法检测待测样本的ret基因no区的rna拷贝数，和通过数字pcr方法检测内参基因的rna拷贝数，计算待测样本的tkd/ic、no/ic和tkd/no；

5、步骤3：根据步骤1确定的tkd/ic、no/ic和tkd/no的阈值和步骤2确定的待测样本的tkd/ic、no/ic和tkd/no，确定待测样本中ret基因是否是ret融合基因。

6、在一种实施方式中，当待测样本的tkd/ic小于其阈值时，判定该待测样本为ret基因融合阴性样本；当待测样本的tkd/ic不小于其阈值且no/ic小于其阈值时，判定该待测样本为ret基因融合阳性样本；当待测样本的ret tkd/ic不小于其阈值，no/ic不小于其阈值，且tkd/no不小于其阈值时，判定该待测样本为ret基因融合阳性样本；当待测样本的rettkd/ic不小于其阈值，no/ic不小于其阈值，且tkd/no小于其阈值时，判定该待测样本为ret基因融合阴性样本。

7、在一种实施方式中，根据置信区间，由该待测融合基因阴性样本确定tkd/ic的阈值；或者利用融合阳性和阴性样本的受试者工作特征曲线法确定tkd/ic的阈值。

8、在一种实施方式中，根据置信区间，由该待测融合基因阴性样本确定no/ic的阈值。

9、在一种实施方式中，根据置信区间，由该待测融合基因阴性样本确定tkd/no的阈值；或者利用融合阳性和阴性样本的受试者工作特征曲线法确定tkd/no的阈值。

10、在一种实施方式中，所述内参基因选择abl1基因、gusb基因、tfrc基因或tbp基因。

11、在一种实施方式中，提供一种在上述方法中应用的数字pcr试剂盒。

12、在一种实施方式中，所述试剂盒包括数字pcr方法检测ret基因tkd区的rna拷贝数引物和探针，通过数字pcr方法检测ret基因no区的rna拷贝数引物和探针，和通过数字pcr方法检测内参基因的rna拷贝数引物和探针。

13、在一种实施方式中，所述试剂盒包括以下引物和探针：

14、

15、

16、在本发明的ret融合基因判读过程中，我们首先使用tkd/ic检测参数。当该参数低于其阈值时，样本被判定为ret融合阴性，表明tkd rna表达量较低，没有发生ret融合。而当tkd/ic不小于其阈值时，表明tkd rna表达量升高。然而，考虑到ret基因扩增也会导致rna表达量整体升高，本发明进一步考虑no/ic。如果no/ic低于其阈值，则样本被判定为ret融合阳性，说明tkd rna表达量高，而no表达量较低，是由于ret融合导致的tkd表达量升高。但如果no/ic不小于其阈值，则表明tkd和no的表达量均升高，这可能是由于基因扩增引起的。在这种情况下，本发明进一步使用tkd/no进行判读。如果tkd/no不小于其阈值，则样本被判定为ret融合阳性；反之，则被判定为ret融合阴性。

17、本方法检测准确，一方面克服了仅使用tkd/ic检测参数可能会误将ret基因扩增造成的ret rna表达量升高误判为假阳性的情况；另一方面也解决了仅使用tkd/no检测参数时，由于no表达为0时无法判读的问题。

技术特征：

1.通过数字pcr方法检测ret融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当待测样本的tkd/ic小于其阈值时，判定该待测样本为ret基因融合阴性样本；当待测样本的tkd/ic不小于其阈值且no/ic小于其阈值时，判定该待测样本为ret基因融合阳性样本；当待测样本的ret tkd/ic不小于其阈值，no/ic不小于其阈值，且tkd/no不小于其阈值时，判定该待测样本为ret基因融合阳性样本；当待测样本的ret tkd/ic不小于其阈值，no/ic不小于其阈值，且tkd/no小于其阈值时，判定该待测样本为ret基因融合阴性样本。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据置信区间，由该待测融合基因阴性样本确定tkd/ic的阈值；或者利用融合阳性和阴性样本的受试者工作特征曲线法确定tkd/ic的阈值。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据置信区间，由该待测融合基因阴性样本确定no/ic的阈值。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据置信区间，由该待测融合基因阴性样本确定tkd/no的阈值；或者利用融合阳性和阴性样本的受试者工作特征曲线法确定tkd/no的阈值。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参基因选择abl1基因、gusb基因、tfrc基因或tbp基因。

7.在权利要求1-6任一方法中应用的数字pcr试剂盒。

8.根据权利要求7所述的pcr试剂盒，其特征在于，包括数字pcr方法检测ret基因tkd区的rna拷贝数引物和探针，通过数字pcr方法检测ret基因no区的rna拷贝数引物和探针，和通过数字pcr方法检测内参基因的rna拷贝数引物和探针。

9.根据权利要求8所述的pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下引物和探针：

技术总结本发明提供通过数字PCR方法检测RET融合基因的方法及其试剂盒，本发明方法包括确定TKD/IC阈值、NO/IC阈值和TKD/NO阈值，计算待测样本的TKD/IC、NO/IC和TKD/NO，从而确定待测样本中RET基因是否是RET融合基因。本发明方法一方面克服了仅使用TKD/IC检测参数可能会误将RET基因扩增造成的RET RNA表达量升高误判为假阳性的情况；另一方面也解决了仅使用TKD/NO检测参数时，由于NO表达为零时无法判读的问题。技术研发人员：祝令香,王继如,杨文军受保护的技术使用者：新羿制造科技（北京）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18