一种ST11型高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的检测方法

本发明属于基因，尤其涉及一种st11型高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的检测方法。

背景技术：

1、碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(crkp)是一种多重致病菌，可在尿道、呼吸道、血液及人体皮肤及软组织中引起感染。产碳青霉烯酶kpc-2的st11克隆是中国crkp的主要克隆，它们可以迅速传播并引起高死亡率和发病率。crkp可通过携带毒力因子编码基因从而进化为高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(cr-hvkp)，常引起多部位或发生侵袭性转移，且目前没有相对有效的治疗手段，对人类公共卫生构成了巨大威胁。黏液样表型调节因子rmpa、rmpa2基因、气杆菌素合成酶iuca基因常作为毒力菌株的遗传标志。

2、现有技术对st11型的cr-hvkp的筛查主要通过全基因组测序和序列分析的方式进行，采用该方法进行筛查，其价格昂贵，周期长，不够便捷，且需要具备生物信息学分析基础才可以进行分析。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种st11型高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的检测方法。

2、本发明是这样实现的，一种st11型高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的检测方法，该方法包括：

3、s1：针对主要碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(crkp)st11型中的毒力基因rmpa、rmpa2及iuca作为分子标记物；

4、s2：从ncbi数据库中下载cr-hvkp中的毒力基因rmpa、rmpa2及iuca；

5、s3：基于以上基因，设计引物，构建特异性反应体系；

6、s4：利用构建的反应体系对携带毒力基因rmpa、rmpa2及iuca的st11型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(crkp)进行检测。

7、进一步，所述毒力基因rmpa、rmpa2及iuca具体为：

8、>iuca

9、gctttatcgactaaattctcattagcataacgagtgagatctgtttgactatgact

10、ttgccaactaaaac

11、ctcaaccttggatgtggctgctcagtgcttccttaattccctagttcgtgaaacca

12、aagactggcggctg

13、acggaataccagccaacccaattgatcatcccgctgggcgaacagcaggcgctcc

14、atttcagagtggctt

15、atttctccccaacccagcatcaccgctttgaatttccggcgcgtctggtcacagca

16、tccggcagtcaccc

17、catcgatttcaccaccctctcccggcttattgttgataagctccagcaccaactct

18、cgctgcccgcgacc

19、agttgcgaaaccttccaccagcgcgtgatggaaagccacgcccatacgcagcaag

20、cgattgatgcccgcc

21、atgactgggcagccctgcgtgaaaaagcgttgaactttggcgaggcggagcaggc

22、tctgctggtcgggca

23、cgccttccacccggcgcctaagtctcatgaaccgtttaaccagcaggaggccgaa

24、cgctacctgccggac

25、ttcgcgccccacttcccgctacagtggtttgcggtggacaaaacgcagatcgccg

26、gtgaaagcctgcatc

27、tcaacctgcaacagcggttgacgcgatttgccgcagagaatgcgccgcagttact

28、caatgaattaagcga

29、caatcaatggctattcccgctgcacccgtggcagggggagtatctgttgcagcag

30、gagtggtgccaggag

31、cttgtcgctaaagggctgattaaagatttaggcgaagccggcgcgccgtggctac

32、cgaccacctcttccc

33、gctcgctctactgcgccaccagcagcgacatgatcaaattctccctgagcgtgcgc

34、ctgaccaactccgt

35、ccgtaccctgtcagtgaaagaagtgaagcgtggaatgcgcctggcgcgcctggcg

36、caaaccgacgactgg

37、cagacgctacaggctcgcttcccgactttccgggtgatgcaggaagacggttggg

38、ccgggctgcgcgatc

39、tccacggcaacatcatgcaggaaagcctgtttgccctgcgtgaaaacctgctggt

40、ggatcagccgcaaag

41、ccagactaacgtactggtctccctgacccaggccgcaccggatggcggtgattcg

42、ctgctggttgcggcg

43、gtaaaacgtctgagcgatcgcctcggcatcactgcgcaacaggccgcccacgcat

44、gggtcgatgcttact

45、gtcagcaggtgctgaagccgctgtttacggctgaagcggattacggcctggtgct

46、gctggcgcatcagca

47、aaatattctggttcagatgcttggggatctgccggtcgggcttatctaccgtgact

48、gtcagggcagcgcg

49、tttatgcctcacgcggcaggctggctcgacaccattggcgaggcgcaggcggaaa

50、acgtcttcacccgtg

51、agcagttgctgcgctacttcccttattacctgctggttaactccacttttgccgtga

52、ccgccgcgctggg

53、cgccgccgggctggacagtgaagcgaatctgatggctcgcgtacgaaccttgctg

54、gctgaagtgcgtgat

55、caggtgactcataaaacctgtctcaactacgtgctggaaaatccgtactggaacg

56、taaaaggtaactttt

57、tctgttatctgaacgaccacaacgagaacaccatcgtcgatccctcggtgatctac

58、ttcgatttcgccaa

59、cccgctgctggctcaggagggctaaatgtctaaggcaaacatcgttcacagcgga

60、tatggactacgctgt

61、gaaaaactcgacaagcctctgaatcttagct

62、>rmpa

63、ttgactgatgattattttttttattatggcctaaagcagttaactggactacctctg

64、tttcatattacat

65、atgaaggagtagttaataaatcaatagcaattaagcacaaaagaaacataagag

66、tattggttgacagcag

67、gattttttattcagggaaatggggagggtacaaaatgttaaggggatcattaaat

68、atgataagccaatgg

69、atgtggcttgacgtttcggggggggggcggttttatcctaaagggtgtgattatga

70、catctatgttaaca

71、tgcaaggaaatgtaaaaaataatattgaaaaactatattttgcattcttaaagaa

72、aaatgttagccgaat

73、tgtaaaccattatccacggctaacaaaaaaggaacaagcagtgctgcaatgccta

74、ctgaaaaatgggggc

75、attaatgaaataaaaagtcaactaaaaattgaagaaaaaacgctatcatgctacc

76、aaagcaaaataacaa

77、gaaaatttggctgcaaaaggtacataaggtttatgtatctttacagccttaataaa

78、gaaatggttgatga

79、aagatggctcatgccaagtatttag

80、>rmpa2

81、atggaaaaatatatttactttatgtgcaataaggatgttacattagtgttaactga

82、tgattattattttt

83、atttcggcctaaagcagttaactggactacctctggtttatattacgtatgaaggc

84、tcgatggataaacc

85、aatagttattaagcagaaaagaaatataagagtattggttgatagccggattttt

86、tattcagggaaatgg

87、gatggttataaaatgttaaggaaaacattaaatatgataagtcaatggatgtggc

88、ttgacatttcggggg

89、ggggggagaagttttatcctcaagggtgtgattatgacatctatgtcaacatgca

90、aggaaatttaaaaaa

91、aaacattgaagagctatattatgcatacttaaagaaaaatgttagccggattgga

92、aatcattacccacaa

93、ctaacaaaaaaagaacaaatcattctacaatgcttactctccaggagggagggca

94、tccatgaattaaaaa

95、gccgtctaaaaattgaagagaaaacactatcgtgtcacagatgtaaaataacaag

96、aaaatttggttgtaa

97、aagattcataagatttatgtatctttacaacttaaataaagaaataactgatgaa

98、aaatggtgcacatca

99、aatacctag

100、进一步，所述引物具体为：

101、iuca-f:agttggtgctggagcttatc

102、iuca-r:ttccttaattccttggttcg

103、rmpa-f:gacggctttttaattcatgg

104、rmpa-r:tattggttgatagccggatt

105、rmpa2-f:ttattcagggaaatgggatg

106、rmpa2-r:gacggctttttaattcatgg。

107、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

108、第一、本发明提供一种st11型高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(cr-hvkp)的检测方法，该方法能够通过识别st11型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌是否存在rmpa、rmpa2及iuca基因，快速区分携带rmpa、rmpa2及iuca毒力基因的高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(cr-hvkp)及经典碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，缩短筛查的周期，为医院感染防控和流行病学调查提供另一种便捷的思路。

109、第二，本发明旨在利用毒力基因rmpa、rmpa2及iuca作为分子标记物，设计特异性引物，从而区分携带rmpa/rmpa2及iuca毒力基因的高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(cr-hvkp)及传统碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，建立st11型cr-hvkp的快速筛查方法，为感染疾病防控及区域播散追踪提供一种便捷有效的思路。

110、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

111、(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

112、st11是我国最流行的肺炎克雷伯杆菌，cr-hvkp由于治疗手段有限、预后不佳，给临床带来极大挑战。本发明通过设计毒力基因rmpa、rmpa2及iuca的特异性引物，解决了以往仅凭表型(拉丝实验)判断菌株毒力的不准确性等问题。本发明通过与医学诊断技术相结合，可显著提高鉴定st11型cr-hvkp的准确性，并为其提供早期干预治疗靶标和预后判断依据，具有较大的商业价值。

113、(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：

114、hvkp的毒力因子类型众多，其中荚膜和铁载体被公认为hvkp的主要的毒力因子。rmpa基因与荚膜的高黏性表型紧密相关；iuca是气杆菌素基因簇最具有代表性的基因。目前表现hvkp最常用的鉴定方法为拉丝实验(即用接菌环粘取菌落可拉伸至少5mm)、动物实验，但近年来越来越多研究发现非高毒力肺炎克雷伯菌也可以出现高黏液表型，动物实验虽然被视为金标准，但费时费力。有研究表示联合rmpa基因与iuca基因等毒力基因鉴定区分hvkp及非hvkp，准确率可达95％以上，因此本发明能实现对st11型cr-hvkp快速、准确地鉴定。

115、(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：

116、由于抗菌药物的广泛使用，hvkp的出耐药率越来越高，出现了越来越多的耐碳青霉烯类hvkp(cr-hvkp),其引起的感染给临床治疗带来很大困难。多药耐药性的hvkp菌株尤其是cr-hvkp，亟须寻求新的策略来应对这种高毒力与高耐药性的cr-hvkp引起的感染，而最重要的是临床上必须快速有效地对hvkp进行鉴定，从而为临床诊疗提供依据。本发明为cr-hvkp的快速准确鉴定提供了可行性。

117、第四，本发明显著的技术进步在st11型高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的检测方法中体现在以下几个方面：

118、1.分子生物学技术的进步

119、基因测序技术：随着新一代测序技术的出现，我们能够更快速、更准确地获取肺炎克雷伯菌的基因组信息。这使得我们能够精确地识别和定位与毒力和耐药性相关的基因。

120、引物设计：随着计算生物学和生物信息学的发展，我们能够更加精准地设计特异性引物，提高pcr检测的灵敏度和特异性。

121、2.多重pcr技术的应用

122、多重pcr技术允许我们同时对多个特异性片段进行pcr扩增后，能通过琼脂糖凝胶电泳检测到目的基因的存在，提高检测的灵敏度。

123、3.数据分析和处理技术的进步

124、大数据分析：随着大数据技术的发展，我们能够处理和分析更大规模的基因组数据，从中发现与毒力和耐药性相关的基因变异和表达模式。

125、人工智能和机器学习：这些技术可以用于优化pcr引物设计、提高pcr检测的灵敏度和特异性，减少人为误差，提高检测效率。

126、本发明的显著的技术进步在st11型高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的检测方法中主要体现在分子生物学技术、多重pcr技术、以及数据分析和处理技术的发展和应用上。这些技术的进步有助于提高检测的灵敏度、特异性和效率，为临床诊断和治疗提供更准确、快速的信息。